哺乳动物皮质颗粒动态运转影响受精的机制研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.研究意义

①受精异常或多精受精现象在动物界较为普遍。

精子和卵子都是单倍体细胞，受精时一个精子进入卵内，与卵子的遗传物质结合，以保证合子重新恢复二倍体。在正常生理条件下，卵黄含量多的动物，如鸟类、鱼类及许多无脊椎动物的受精过程中有多个精子入卵，卵子中出现多个雄原核，但最终只有一个雄原核与雌原核融合，完成正常的胚胎发育，而其它雄原核在发育中途退化(1)。而哺乳动物是单精受精动物，如果一个以上精子入卵，通常会导致胚胎发育异常或发育阻滞，最终夭折。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

通过利用皮质颗粒标识物ovastacin的荧光标签转基因小鼠，综合应用分子生物学和细胞生物学学等手段，明确皮质颗粒在卵母细胞成熟和受精过程中的转运及调控机制，阐明皮质颗粒转运和释放异常导致受精失败和引起多精受精的根本原因，为全面了解哺乳动物皮质颗粒在生殖医学和家畜家禽繁殖学中的意义提供研究基础。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1采取的研究方法

①观察细胞骨架对皮质颗粒迁移的影响：将3-4周ovastacin-mcherry转基因小鼠的gv期卵母细胞（直径大约60um）在分别含有微丝解聚剂cytochalasind（5ug/ml），微管解聚剂nocodazole（10um），微丝成核因子arp2/3复合物抑制剂ck-666（50um），微丝成核因子formin抑制剂smifh2（25um），微管动力蛋白kinesin抑制剂monastrol（50um），以及微管动力蛋白dynein抑制剂ciliobrevind（50um）的m16培养液中进行培养观察。timelapse成像通过配有planapochromatx40/1.2na水浸物镜的zeisslsm510meta共聚焦显微镜来完成，mcherry使用561nm激光激发，图像通过软件timeseriescontrol功能来获取（扫描10层，层隔：5um；时间间隔：10分钟；总时间：3小时）。

②皮质颗粒动态定位被抑制后的卵子的精卵结合、zp2切割和体外受精实验：将6-8周ovastacin-mcherry转基因小鼠的卵母细胞，在分别含有微丝解聚剂cytochalasind（5ug/ml），微管解聚剂nocodazole（10um），以及脂类运动抑制剂methyl-β-cyclodextrin（10mm）的m16培养液中进行frap实验。frap实验通过zeisslsm510meta的bleachcontrol功能来完成（561nm激光强度：40%；重复次数：10）。在选取区域的mcherry荧光被漂白后，利用timeseriescontrol功能来获取图像观察荧光的恢复（扫描1层；时间间隔：1分钟；总时间：1小时）。将卵子与10-12周正常雄鼠的附睾尾精子（4x105/ml）在htf培养液中于37度培养箱孵育5-6小时进行体外受精反应，受精后的卵子转入ksom中过夜培养。次日检测受精率或多精受精率。

4. 研究创新点

1）本项目瞄准生殖生物学领域一直悬而未决的科学问题，即哺乳动物卵母细胞皮质颗粒的成分和功能来展开研究，并首次利用最新鉴定出的首个哺乳动物皮质颗粒成分ovastacin作为标识物，具有学术视角的创新性。

2）本研究以转基因小鼠为模型，通过活细胞成像技术，密度梯度离心结合荧光激活分选技术，全面系统地记录皮质颗粒在受精前后的动态转运、释放过程，以及鉴定分析其新成分和新功能，阐明皮质颗粒在保证成功受精过程和预防多精受精等生物学过程中的意义，具有研究策略和方法的新颖和独特性。

3）该项目不仅能进一步深入揭示受精和多精受精的分子机理，而且能为提高体外受精的成功率、优化人类辅助生殖技术以及改善家畜家禽的遗传育种工作提供理论支持。

5. 研究计划与进展

1.研究计划

2015年9月2015年10月查阅文献，确立课题，完善实验计划，申请项目；

2015年10月2015年11月预实验，熟悉实验操作；