Ovastacin在哺乳动物卵子受精后的动态变化研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

受精是单倍体的生殖细胞融合产生一个遗传学上截然不同的新生命的过程，它是有性生殖的起点，更是绝大多数哺乳动物繁衍后代的重要形式。根据不同的动物种类，受精可以发生在体外，也可以发生在体内，此过程将携带遗传信息的单倍体细胞重新结合成双倍体，既恢复了物种正常的染色体数目，又保证了双亲的遗传作用。同时，受精可以把生殖细胞通过减数分裂同源重组获得遗传物质变化和个体发生过程中产生的变异遗传下去，从而保证了物种遗传的多样性，这在生物进化上具有重要意义^[1]。因此为保证合子重新恢复为二倍体，受精时只需要1个精子入卵。如果有1个以上精子入卵，通常会导致胚胎发育异常或阻滞，最终夭折^[2]。对于人类而言，即使顺利产出三倍体或四倍体的婴儿，通常都伴有严重的功能缺陷或异常的疾病，在绝大多数情况下便会自然流产^[3]。因此为阻止多精受精的发生，体内受精过程中存在着两个系统，第一个系统是雌性生殖道减少了精子自发到达卵母细胞表面的数目^[4]，第二个系统是卵母细胞对多精子穿透的直接阻止反应即皮质颗粒和透明带反应^[5]。

皮质颗粒仅在雌性生殖细胞中合成，是由高尔基体衍生而来的一种圆形、外包界膜的细胞器^[6]。受精将引发大量的皮质颗粒迅速地向质膜迁移，并依赖钙调蛋白和由SNARE蛋白介导的胞吐作用把内容物释放到周围空间中^[7]，释放的皮质颗粒蛋白质通过修饰卵母细胞的细胞外基质结构和成分来阻止多精症的发生。研究发现小鼠的透明带包含ZP1、ZP2、ZP3三种糖蛋白^[8]，其中ZP2上存在着精子的结合位点，并且在精卵融合之后被切割，从而防止多精受精^[9]，而由皮质颗粒分泌的ovastacin被认为是作用于ZP2的蛋白酶^[10]，负责切割ZP2上精子的结合位点。Ovastacin由单拷贝基因Astl编码，隶属于虾红素金属蛋白酶家族，目前已经证明它的功能之一是断开ZP2二元碱残基的上游部分，利用LAC-FITC标记皮质颗粒后显示ovastacin与皮质颗粒共区域，但在受精后ovastacin定位消失^[11]。

虽然上述过程在小鼠中只需要几小时就能完成，并确保精子不再结合于透明带的表面^[12]，但对于猪的研究鲜有报道。而猪作为一种重要的家畜，与其他动物相比多精受精率之高，在体外为50%-80%^[4]，严重影响了母猪的繁殖力和生产性能，不利于畜牧业的高效快速发展。因此，本项目将从鼠与猪两种哺乳动物在受精后ovastacin的动态变化过程入手，分析它们的异同之处，初步探究哺乳动物阻止多精受精的机制，以及分析和认识猪卵发生多精受精的机理，希望对提高母猪的繁殖力和生产性能具有重要理论意义和实践价值。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究的目标

利用卵母细胞的收集和体外培养、免疫荧光染色、体外受精、早期胚胎培养等技术同时研究鼠与猪两种哺乳动物在受精后ovastacin的动态变化过程，为解析猪卵多精受精的发生机理和提高家畜繁殖潜力提供理论基础。

2. 研究的内容

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法和实验方案

（1） 小鼠卵母细胞的收集与体外培养

将小鼠脱颈致死，然后打开小鼠腹腔摘取两侧卵巢，放入平衡好的小鼠体外操作液m2做的小液滴中备用，然后在培养皿里用刀片将取出的卵巢剁碎并用m2培养液冲开，接着在体式显微镜下用口吸管捡取形态正常的gv期卵母细胞。捡取的卵母细胞用m2培养液清洗去除杂质后转移至平衡好的m16培养滴中，盖上石蜡油，放入37°c、5%co₂的培养箱内培养。

4. 研究创新点

随着人工授精技术、胚胎移植和克隆技术的不断发展，使得家畜的繁殖力和生产性能得到了明显改善与进步，但当猪卵母细胞在体外成熟和受精时，多精受精率可达50%-80%，由此产生的多倍体胚胎与正常胚胎相比，会出现囊胚内细胞团细胞数明显减少、囊胚染色体倍性不正常、配子配合前的原核发育迟缓等问题，严重阻碍了畜牧业的高效发展。

在小鼠的研究中发现皮质颗粒分泌的ovastacin通过切割ZP2上精子的结合位点，从而阻止多精入卵的发生，并且该过程在小鼠卵中只需要几小时就能完成，从而确保精子不再结合于透明带的表面，但对猪卵的研究较少，因此本项目将从小鼠与猪两种哺乳动物受精后ovastacin的动态变化过程入手，分析它们的异同之处，初步探究哺乳动物阻止多精受精的机制，以及分析和认识猪卵发生多精受精的机理，希望对提高母猪的繁殖力和生产性能具有重要理论意义和实践价值。

5. 研究计划与进展

1. 研究计划

本项目在老师的指导下于2019年5月起围绕课题意义、国内外研究背景、应用前景等开展了相关文献的查阅，并将重要内容撰写为专业文献综述一篇，同时在实验室学习相关实验操作，确保后续实验安全、规范、顺利地开展，以在规定时间内保质保量地完成项目内容。

2. 预期进展