Nipbl调控小鼠卵母细胞纺锤体组装的作用研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在动物的繁殖过程中，胚胎的非整倍体是造成自然生殖和辅助生殖中胎儿流产、死亡或者先天性出生缺陷的重要原因。在哺乳动物中，不论是有丝分裂还是减数分裂，都有可能导致出现胚胎非整倍体。在早期胚胎中出现的非整倍体现象最早可以追溯到配子在减数分裂时期发生了染色体装配错误，值得关注的是这样的错误在雌性配子中出现的几率要比雄性配子中出现的概率更大。这可能是因为雄性细胞的周期性检查点机制相较于雌性更为强大，其可以将减数分裂错误的细胞成功的清除。纺锤体组装检查点是细胞分裂过程中最重要的监督机制，由多种蛋白组成并发挥作用，在细胞分裂时这些蛋白被有序地招募到动粒，用以保证分裂时期染色体的正确排列与精确分离，在整个减数分裂过程中，纺锤体组装检查点发挥着严格的监督作用，监视分裂中期染色体的排列及纺锤体组装，直到所有的动粒-微管粘附都处在正常状态后才允许分裂进入下一时期。不同于雄性，雌性配子的纺锤体组装检查点机制好像要弱得多，表现在当仅有单一染色体未准确对齐时，减数分裂的进程并不能被及时准确地阻断，在小鼠卵母细胞中具体表现在往往还没等到染色体完成附着、配对等相关过程，减数第一次分裂后期就已经开始了，有研究表明是可能是由于缺乏中心粒而导致卵母细胞形成了组装慢，稳定性差，形状奇特的非正常纺锤体有关，但是缺乏更深入的研究^[1-3]。因此，研究卵母细胞纺锤体组装这一过程对于保证卵母细胞正常进行减数分裂具有较大意义。

粘连蛋白cohesin是一种多亚基结构，它帮助单个染色单体内的基因座之间的相互连接产生三维圆柱结构，并使其与它们的姐妹染色体形成多个连接，介导姐妹染色单体内聚以维持染色体的结构稳定，以及减数第一次、第二次分裂后期姐妹染色单体的准确分离都起到了重要作用,主要表现在cohesin在dna复制过程中建立起凝聚能力，在m期丧失而使得染色体分离^[4-7]。粘连蛋白cohesin与染色体的结合被一种名叫kollerin的二元蛋白复合物调控，其由nipbl的大型保守蛋白和名为mau2的较不保守的较小蛋白组成^[5]，即nipbl / mau2复合物。kollerin分为三个不同的连续区域，通过三个区域间的高度灵活性形成了紧密和延伸两种构象，而两种构象的相互转变介导了粘连蛋白环的开张和闭合，最终介导减数分裂中姐妹染色单体的内聚和分离^[8]，从而保证了生殖细胞减数分裂的正常进行。vesnes等人^[9]在减数分裂前期发现明显的性别二态性，即nipbl / mau2复合物在雄性生殖细胞的中期/晚期粗线期和双线性期间与染色体结合，在中期粗线期精母细胞中，第一次减数分裂仅仅几天之后，大部分nipbl / mau2复合物可能不再需要在轴上加载粘连蛋白并被去除或重新定位到染色体中。但在发育中的卵母细胞中与染色体轴保持稳定相关。由此我们很容易推测，在卵子发生过程中需要nipbl / mau2复合物来维持粘连蛋白cohesin的结合和凝聚力，并且这种状态可能要持续数月。在kuleszewicz等人^[10]利用针对nipb1的两种不同抗体处理雄性和雌性母细胞中nipb1的染色实验同样证明了一点。这些都表明了nipbl/mau2二元复合物在哺乳动物减数分裂的早期就开始发挥作用了，并且在雌性生殖细胞中对于保证完成正常减数分裂具有重要作用。

在一些模式动物中的研究都显示，nipbl同源物已被证明可定位于酵母，果蝇，线虫，拟南芥和鸡腿菇中的减数分裂染色体轴^[11-15],并且nipbl缺乏会造成它们在减数分裂时期发生细胞学或功能缺陷，如酵母发生姐妹染色单体的内聚、核分裂和多个基因的转录调节异常，果蝇发生联会复合体的过早分离，秀丽隐杆线虫的dna双链断裂无法正常断裂等^[9]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

采用小鼠卵母细胞体外成熟、蛋白质免疫印迹试验、融合荧光蛋白载体构建、显微注射技术、免疫荧光染色等手段，明确nipbl基因在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位，为阐明nipbl基因在调控小鼠卵母细胞纺锤体组装过程中的作用，为后续探索nipbl基因在卵母细胞减数分裂过程的功能和作用机制提供理论依据。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法

本课题以小鼠卵母细胞为研究对象。一是通过注射nipbl基因的sirna的方式实现敲低gv期小鼠卵母细胞中nipbl基因的目的，进而与正常gv期卵母细胞、敲低nipbl基因后各发育阶段的卵母细胞进行横向和纵向比较，分析nipbl基因对小鼠卵母细胞gvbd率、染色体状态、纺锤体状态、微管稳定性、成熟率等各项重要指征的影响；二是提取小鼠总rna，通过逆转录、聚合酶链式反应等手段获取nipbl基因片段，用以构建nipbl-mrfp融合荧光蛋白载体，显微注射入gv期小鼠卵母细胞后结合小鼠卵母细胞体外培养技术、免疫荧光技术实现对nipbl基因在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位，最终揭示nipbl基因在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用。

2.技术路线

4. 研究创新点

1.目前关于Nipbl的研究已经有了很大的进展，对其在减数分裂时期的作用有了一定的了解，如Nipbl缺乏会导致减数分裂时期发生一些细胞学或功能缺陷。但是对于Nipbl在减数分裂时期的具体作用仍然知之甚少，尤其是Nipbl对纺锤体组装方面的研究几乎更少。而本课题恰恰着眼于此，以期探索出Nipbl在小鼠卵母细胞减数分裂过程中起到的作用。

2.本课题尝试构建Nipbl-mRFP融合荧光蛋白载体用于定位各发育阶段小鼠卵母细胞内Nipbl的位置信息，是一个创新之处。

5. 研究计划与进展

1.研究计划

本人自2017年12月起，就一直在指导老师课题组实验室学习卵母细胞相关知识和相关实验操作及技术，通过平常在实验室的所学所见，最终在指导老师的指导与帮助下确立了本项研究课题。另外本人根据研究课题的内容所需积极查阅了大量国内外相关文献资料，对nipbl基因、小鼠卵母细胞减数分裂过程中如纺锤体组装和小鼠卵母细胞的体外成熟等相关理论知识和当下研究现状均有了较为清晰的认识和理解。同时本人通过与指导老师、实验室各师兄师姐们的学习与交流已经基本掌握了本课题涉及到相关实验基本操作。

2.研究计划的预期进展