除草剂阿特拉津对绵羊睾丸间质细胞增殖与调亡影响的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

阿特拉津(atrazine)是一种低毒的除草剂，在农业生产中得到广泛的应用，但其也同样是近年来国际社会广泛关注的重要环境污染物之一。阿特拉津的水溶性大，在土壤中较易移动，易被雨水淋洗至较深层，致使对某些深根性杂草有抑制作用，但也让阿特拉津更易留下残留。阿特拉津因其化学结构稳定，难以降解，可经常在大气、水与土壤中发现残留，在人与动物体内也会被检测到^[1,2]，若是在环境中长久存在会对人类健康造成重大影响。早在2010年就有研究者发现，阿特拉津会干扰雄蛙的激素分泌，使雄蛙变性^[3]。在此后的多项研究结果显示，阿特拉津是一种内分泌干扰物^[4]，其具有与天然性激素相近的对血清组分的结合能力^[5]，并可能与天然性激素发生竞争，引发生殖功能障碍，导致睾丸发育异常，干扰精子生成^[6]。

睾丸间质细胞，即leydig细胞。分布于生精小管之间的疏松结缔组织中，细胞含量占睾丸总细胞数的2%-4%。其主要功能，分别是合成和分泌雄激素。雄激素是一种含有19个碳原子的类固醇激素，主要有睾酮和雄烯二酮，睾丸间质细胞主要负责合成和分泌睾酮^[7]。睾酮是一类活性最强的雄激素，它在促进雄性生殖机能的发育上起了重要的作用。在生长发育过程中，睾酮可以使雄性出现第二性征，使内外生殖器官的发育成熟，同时维持生殖器官的正常生理功能。在睾丸内部，睾酮可以促进精子的发生及成熟。在身体内部，睾酮可以促使部分机体蛋白质的合成。雄激素也会受到某些负反馈机制的调控，使其分泌稳定进行^[8]。

近年来，阿特拉津的内分泌干扰效应和生殖毒性已引起研究者越来越多的关注。相关文献显示阿特拉津具有雄性生殖毒性。在大鼠身上的试验显示阿特拉津可导致雄性啮齿类动物产生生殖器官变性萎缩、生精过程受阻、睾丸标志酶活性下降、性激素水平紊乱等毒性作用^[9]。但是，当前关于atz的毒性试验主要是在水生动物身上展开的^[10]，哺乳动物的试验大多是在小鼠与大鼠身上进行，大型动物身上的相关试验较少。细胞体外毒性试验具有简便、省时、重复性好、毒性终点明确等优点，已在生殖毒理学研究中得到越来越广泛的应用。本试验拟研究阿特拉津对原代培养的绵羊间质细胞的增殖、凋亡及睾酮分泌的影响，为探讨阿特拉津对间质细胞的毒性作用机制提供理论基础，同时也具有一定的实际应用价值。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标：探究除草剂阿特拉津对绵羊睾丸间质细胞增殖和凋亡的影响。

2.试验的内容：将绵羊的睾丸间质细胞进行体外培养，然后选取不同浓度的atz进行染毒处理。用cck8试剂盒检测atz染毒后的细胞活力，选取其中一个合适的浓度进行后续试验。首先选用qrt-pcr和western blot检测凋亡相关基因的表达变化，然后使用edu掺入法检测染毒组和对照组的细胞增殖情况。使用elisa法检测培养液中的睾酮浓度，同时用qrt-pcr和western blot检测睾酮合成相关基因的表达水平变化，最后检测氧化应激相关基因的表达变化。

3.拟解决的关键问题：本试验是间质细胞的体外试验，需要将间质细胞进行体外培养，因此间质细胞的分离、纯化和培养就成了一个关键的步骤。此外，为了检测间质细胞的增殖与凋亡情况，需要对间质细胞内基因的表达水平进行检测，包括与氧化应激相关的cat、sod2和gsh-px，与细胞自噬相关的lc3、p62以及beclin-1，与细胞凋亡相关的bcl-2、p53、caspase-3和caspase-9，与睾酮分泌相关的star、hsd3β、cyp11a1和cyp17。

3. 研究的方法与方案

1.拟采取的研究试验方法、试验手段、关键技术

酶联免疫吸附测定（elisa）：利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。

4. 研究创新点

目前关于ATZ的毒性研究大多都是以水生动物为研究对象，有关哺乳动物的实验基本是在小鼠这样的模式生物身上进行的。本试验以绵羊为研究对象，不仅可以探究ATZ对大型哺乳动物的生殖毒性，同时也与现实生产环节相关，具有一定的实际应用价值。

此外，对ATZ的毒性研究多以整体动物为模型。本试验则是研究ATZ对原代培养的间质细胞活力、细胞凋亡及睾酮分泌的影响。间质细胞的体外毒性试验具有简便、省时、重复性好、结果明确等优点。

5. 研究计划与进展

2019年5月-6月:查阅相关文献，写综述，学习相关实验技术。

2019年7月- 2020年3月:进行实验，包括间质细胞的培养与染毒，间质细胞生物活性的测定，相关基因表达水平的测定，培养液中睾酮浓度的测定。

2020年4月:数据分析，阅读文献，准备撰写论文。