miRNA-27a 克隆、SNPs筛选及其与湖羊产羔数的关联分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、国内外研究现状

microrna是一类小的短链（20-25nt）非编码的内源表达rnas，通过直接与靶基因3’utr的不完全结合而抑制靶基因mrna翻译，在转录后水平阻断靶基因的表达，参与调控相应基因的生物学功能[1-3]。大量研究表明，mirna 在哺乳动物的发情启动、激素分泌、卵泡发育、精子形成以及胚胎着床等环节都存在严密的分子调控[4]。

mir-27a属于mir-27家族成员之一[5]，参与调控动物生殖。研究发现小鼠mir -27a表达上调，卵母细胞成熟率增多[6]。mir-27a能增强乳腺癌细胞mcf-7雌激素受体α的表达，影响雌激素（e2）的代谢[7]，使雌激素合成关键酶—芳香化酶表达下降抑制雌激素的分泌[8]。对于卵巢早衰（pof）的患者，其血浆中的mir-27a表达明显上调，而治疗后mir-27a表达量则下降，说明pof受到上述基因的调控[9]。wang等[10]研究证实，mir-27a-3p表达上调促进颗粒细胞凋亡，且mir-27a-3p通过靶向调节小鼠多囊卵巢综合征模型中颗粒细胞中creb1影响雌二醇和雄激素失衡，其可能参与了多囊卵巢综合征（pcos）的病理生理过程。猪mir-27a基因的t/c突变与产仔数有关，有可能作为猪繁育过程中产仔数的分子标记[11]。

2. 研究的基本内容和问题

研究内容本项目有以下2方面研究内容： 1. 湖羊miR-27a序列克隆及组织表达谱鉴定 2. 湖羊群体内miR-27a SNPs 筛选及与湖羊产羔数的关联分析研究目标 1. 获得湖羊miR-27a序列 2. 鉴定miR-27a在湖羊群体中SNPs位点拟解决的关键科学问题 本项目拟解决的关键科学问题为（1）miR-27a在湖羊中表达特征；（2）miR-27a能否作为绵羊产羔数的分子标记应用于绵羊育种。

3. 研究的方法与方案

研究方法1. 酚-氯仿方法提取湖羊dna， 以湖羊dna为模板， pcr方法克隆获得湖羊mirna-27a序列1.1 dna提取：酚-氯仿方法

[1]准备灭菌的ep管，裂解液，苯酚-氯仿-异戊醇混合物(体积比25:24:1)，70%乙醇置于4℃冰箱，含20ug/ulrnase的te溶液，蛋白酶k。

[2]用剪刀剪下绿豆大小的耳组织样于1.5ml灭菌ep管中，尽可能剪碎;

[3]加入裂解液800ul及蛋白酶k10ui(20ug/ui); [4]50℃水浴裂解到无组织样为止(14-24h); [5]取出ep管，12000g离心10min; [6]取上清到另一个ep管中，加入800ul苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀10min后，12000g离心10min; [7]取上清，重复上一步; [8]取上清，加入800ul氯仿，混摇10min; [9]取上清，加入600ul异丙醇，混摇10min; [10]12000g离心10min，弃上清，用70%冰乙醇1ml清洗2次，4℃离心5min，用枪头吸干乙醇，注意枪头不要碰到沉淀物; [11]将dna样置超净工作台内吹干; [12]每个样本加100ul含20ug/ulrnase的te溶解37℃1h; [13]电泳看dna提取效果，测浓度后稀释用于模板扩增基因。1.2 pcr扩增 pcr扩增反应程序为95°c预变性5min；95°c 30s，60°c退火30s，72°c 延伸1min，72°c彻底延伸5min，30-35个循环；扩增产物4°c保存。20μl反应体系组份为：taq酶为10μl，模板dna为1μl，上下游引物各1μl，ddh2o为7μl。pcr反应完毕，取10ul反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。1.3基因克隆及测序( 1 ) pcr产物切胶回收 将pcr产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的dna片段。使用tiangen公司的universal dna purification kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下： [1]平衡吸附柱：向吸附柱cb2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液bl，13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱cb2重新套回收集管中； [2]按100 mg agarose胶加入100μl 溶液pc，置于50oc中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化； [3]将样品倒入一个吸附柱cb2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱cb2重新套回收集管中； [4]向吸附柱cb2中加入600μl 漂洗液pw（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱cb2重新套回收集管中； [5]重复上一步骤； [6]将吸附柱cb2放入收集管中，室温下13,400g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干； [7]将柱子套入一新的灭菌1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的dna纯化液； [8]取5μl的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中dna含量。( 2 ) 目的片段与载体连接 胶回收产物与t载体连接体系，参考takara公司pmd19-t载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 ml 离心管中配制如下溶液（10 μl）：pmd19-t vecter 1ul, insert dna 0.1 pmol-0.3pmol, dh2o 补齐至5ul。加入5ul等量的solution i，16℃反应30分钟，所得产物保存于－4℃冰箱备用。( 3 )连接产物转化e.coli dh5α [1]冰上融化感受态，将连接产物加入到100μle.coli dh5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上孵育5min； [2]42℃水浴热激转化45 s，立即放回冰上，放置2 min； [3]每管加入500 μl lb培养基（室温放置），37℃ 160-180 rpm振荡培养45-60 min，使菌体复苏并表达抗性基因； [4]在含有amp（100 μg/ml）的选择性平板上加入60-100 μl 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用parafilm膜封好；

[5]将培养皿正放，待液体全部吸收后，倒置平板于37℃恒温箱继续培养10-16 h。

4. 研究创新点

首次将miR-27a与湖羊产羔数联系在一起，获得其在湖羊组织中的表达模式，筛选鉴定湖羊的SNPs位点，为高繁殖力绵羊分子育种提供理论依据。

5. 研究计划与进展

2019.07- 2019.10：完成mirna-27a克隆试验、组织表达谱分析

2019.11- 2020.02：完成mirna-27a 基因分型，分析其与湖羊产羔性能的相关性

2020.03-2020.05：分析数据，撰写论文