姜黄素对猪圆环病毒2型复制的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

姜黄素是一种从姜黄根茎提取的具有生物活性的天然多酚类化合物。

据报道，姜黄素能够影响细胞代谢，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗病毒和免疫调节等活性，在急慢性炎症中，姜黄素在体内能够起到很好的防护左右，炎症发生时姜黄素可以抑制能够产生活性氧簇酶类的活性，能够抑制皮肤炎症和相关基因的表达以及过氧化氢的形成。

除此之外，姜黄素还有抗微生物的作用，但相关报道较少。

2. 研究的基本内容和问题

1. 项目实践的目标、内容和拟解决的关键问题。

1.1 目标

利用现有的姜黄素（纯度94%），处理pcv2感染的pk-15细胞，探究分析姜黄素在体外对pcv2在细胞上复制的影响。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法

分离纯化PCV2毒株，使其分别与 0μM、5μM、10μM、15μM姜黄素在37℃温箱孵育1h后，再与PK-15细胞孵育1h，细胞维持液培养细胞3-5d后，提取细胞中的PCV2 Cap蛋白，通过Westernblotting检测蛋白表达量；提取PCV2 DNA，通过q-PCR测定DNA拷贝数；并通过间接免疫荧光的方法比较有无姜黄素的条件下，病毒的复制量有无变化。

2 实验方案

2.1分离纯化PCV2毒株

用剪刀剪取病变明显的肺脏部位和淋巴结，置于小青瓶或平皿中，用小剪刀剪成大小约1mm³的碎块，然后加入适量灭菌生理盐水，置于玻璃匀浆器中进行匀浆，组织匀浆液倒入小青瓶中，置于-20℃冰箱冻存备用。

2.1.1 病料的无菌处理

（1）将保存的组织悬液反复冻融三次，将组织悬液加入EP管中，12000 rmp离心15min，取上清；

（2）将灭菌的小滤器置于无菌的小青瓶上，用注射器吸取离心后的上清，将注射器与滤器相接，用力压注射器活塞，使上清通过滤液，滤液即为无菌的含有病毒的组织上清。

2.1.2 病毒接种

（1）取制备好的70%-80%铺满的单层PK-15细胞，在紫外照射过的超净台中；

（2）弃去细胞板中的培养液，PBS清洗2次；

（3）在细胞板中加入过滤后的组织上清液800μl，使其铺满细胞表面，置于37℃二氧化碳培养箱孵育1h；

（3）弃去组织滤液，在细胞中加入细胞维持液5ml，37℃二氧化碳培养箱培养。

2.2 细胞毒性试验

采用MTT法进行测定姜黄素的细胞毒性。

（1）将PK-15细胞以3×10³个细胞孔的密度加到96孔培养板中培养24 h；

（2）试验结束前4 h向96孔培养板中添加15 μl MTT（5mg/ml）孵化4 h；

（3）测量结束时去除96孔板中培养基，每孔添加150 μl DMSO；

（4）室温下震荡10 min，570 nm波长检测其OD值，所有试验重复3次。

2.3 PCV2 TCID50测定

PCV2 TCID50 采用间接免疫荧光法进行检测，具体操作步骤如下：

（1）PCV2感染的PK-15细胞经过不同处理后反复冻融3次，收取PCV2病毒液；

（2）将收取的PCV2病毒液从10^-1-10^-8作10倍倍比稀释；

（3）将稀释好的病毒液分别加入96孔培养板中，每一稀释度5个重复，感染72 h，同时设立不感染病毒的阴性对照组；

（4）PK-15细胞使用含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗3次，每次5min，清洗后每孔使用4%多聚甲醛常温固定20 min；

（5）固定后再用PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的磷酸盐缓冲液（PBS）在37℃孵育1 h，以阻断非特异性结合；

（6）封闭后再用PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的PBS按1:50比例稀释的PCV2一抗，37℃孵育1 h；

（7）PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的PBS按1:100比例稀释的FITC标记的荧光二抗，37℃孵育1 h；

（8）PBST清洗3次，每次5 min，然后在 荧光显微镜下观察结果；

（9）使用Reed-Muench法计算PCV2 TCID50.

2.4 PCV2抗原量检测

利用间接免疫荧光试验（IFA）检测姜黄素对PCV2抗原的影响，实验过程中设感染PCV2的无姜黄素组为对照组，用IFA比较添加姜黄素的实验组的PCV2的抗原量，具体操作步骤如下：

（1）PK-15细胞使用含有0.1%PBST清洗3次，每次5 min，清洗后每孔使用4%多聚甲醛常温固定20 min；

（2）固定后再用PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的PBS在37℃孵育1 h，以阻断非特异性结合；

（3）封闭后再用PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的PBS按1:50比例稀释的PCV2一抗，37℃孵育1 h；

（4）PBST清洗3次，每次5 min，随后每孔添加含有1%BSA的PBS按1:100比例稀释的FITC标记的荧光二抗，37℃孵育1 h；

（5）PBST清洗3次，每次5 min，然后在 荧光显微镜下观察结果。

2.5 Western blotting 检测蛋白表达

2.5.1 蛋白样品制备

细胞培养后，弃去细胞培养液，用预冷的PBS溶液洗涤3次，加入适量的RIPA裂解液（含有1 mM PMFS），摇匀置于冰上放置2 min，用细胞刮快速将细胞刮下，收集细胞碎片与裂解液于新离心管中进行超声破碎，于4℃，12000 rmp离心20 min，收集上清液即所需蛋白样品。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒操作步骤测定蛋白样品浓度，按比例加入5×SDS-loading buffer，然后进行蛋白变性（95℃，5 min）。蛋白样品变性后-80℃保存备用。

2.5.2 SDS-PAGE 电泳

1）制胶与上样

根据目的蛋白大小选择合适浓度的分离胶，按配方配制后，使用1ml移液器将分离胶缓慢注入两层玻璃板中，在分离胶上缓慢加入甲醛进行封胶，保证胶面平整。待分离胶充分凝固后，倒去甲醛并用吸水纸吸干。将配置好浓缩胶注入分离胶上层，然后插入梳子并防止两端留有气泡。浓缩胶凝固后，即说明凝胶配制完成。

将等质量的蛋白样品添加至胶孔中，一侧添加蛋白Marker作为参考（为了防止样品扩散，加样时需要迅速）。

2） 电泳与转膜

上样完毕后，选择适当的电压进行电泳。一般选择：浓缩胶80V 30 min，分离胶120 V 60-90min，至溴酚蓝快跑出或目的蛋白能够切出时即可终止电泳。

电泳结束后，采用半干电转印法将目的蛋白从凝胶中转移至PVDF膜上（电压20 V，时间40-50min）。

3）免疫检测

（1）将PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10min。然后将膜置于含有5% BSA的TBST封闭液中，室摇床摇动封闭1h；

（2）将PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10min，加入用封闭液按比例稀释的一抗溶液，4℃孵育过夜；

（3）将PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10min，加入用封闭液按比例稀释的酶标二抗溶液，温室摇床孵育1h；

（4）将PVDF膜使用TBST清洗3次，每次10min，用ECL发光液对PVDF膜孵育1-2min，然后将膜置于凝胶成像系统中显影成像，并采用Image-proPlus对蛋白条带进行灰度分析并计算。

2.6 q-PCR测定PCV2 DNA拷贝数

PK-15细胞中PCV2 DNA拷贝数采用q-PCR进行测定。

PK-15细胞经过不同试验处理后，按照以下步骤提取DNA（PCR模板）：

（1）细胞清洗后加入500 μl PBS，将细胞反复冻融3次，收取PCV2病毒液；

（2）吸取450 μl PCV2 病毒液与SDS和蛋白酶K混匀，55℃水浴1 h；

（3）使用苯酚/氯仿（1:1）抽提一次，4℃，12000 rpm离心5 min，吸取上清液；

（4）向上清中加入1/10体积的乙酸钠以及2.5倍体积的无水乙醇，置于4℃沉淀1 h，然后4℃，12000 rpm离心15 min；

（5）去上清，用75%乙醇清洗一次，随后4℃，12000 rpm离心5 min；

（6）去上清，打开管盖，室温干燥5 min；

（7）用50 μl超纯水悬浮沉淀，置于-20℃冰箱备用。

根据GenBank上发表的PCV2 ORF2核苷酸保守序列，设计并合成一对引物，上游引物（PCV2-F）为5’-TAGTATTCAAAGGGCACAG-3’，下游引物（PCV2-R）为5’-AAGGCTACCACAGTCAG-3’，用以扩增107bp的PCV2特异性片段。用含有PCV2基因组的pMD-19-T重组质粒构建q-PCR的标准曲线，并应用SYBRgreen real-time PCR kit检测PCV2DNA拷贝数。

3 技术路线

分离纯化PCV2毒株

IFA法比较有无姜黄素条件下PCV2的抗原量

WB比较有无姜黄素条件下Cap蛋白表达量的差异

比较有无姜黄素条件下 PCV2的TCID50 有无变化

MTT法进行测定姜黄素的细胞毒性

q-PCR比较有无姜黄素条件下PCV2 DNA拷贝数的差异

得出结论：姜黄素对PCV2复制的影响

4可行性分析

1、 丰富的科研经验

指导教师吴文达老师现任动物医学院临床医学系副教授、硕士研究生导师、美国毒理学会会员、中国毒理学会会员、江苏省毒理学会青年委员、兽医毒理专业委员会委员。BMC Vet Res、Toxicol Sci 等国际知名刊物审稿人。主持国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、中央高校科研基本业务费、中国博士后科学基金面上一等资助、中国博士后科学基金特别资助等项目。其一直从事真菌毒素毒性机理、致病分子机制、畜禽中毒病与食品安全、小动物疾病等研究。近5年在 Arch Toxicol、ToxicolSci 等国际知名刊物发表SCI论文 18 篇，其中第一或通讯作者SCI论文14篇，累积影响因子大于50，单篇最高影响因子6.637。论文大部分发表在学科前20%的杂志，其中7篇发表在学科前10%的杂志。

2、成熟的实验室技术

南京农业大学动物医学院实验室设备完备，拥有荧光定量PCR分析仪、RT-PCR仪、自动生化分析仪、荧光显微镜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、酶联免疫自动分析仪、多功能通风橱、754-紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机、超净工作台、旋转蒸发仪、真空干燥箱、冷冻干燥机以及细胞培养室等，具备细胞分离培养、免疫学等试验所需的基本仪器及条件。

4. 研究创新点

创新之处

已知姜黄素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗病毒和免疫调节等活性，目前国内已有实验室发现姜黄素可抑制猪蓝耳病病毒的复制，并探究其机制为姜黄素可以使病毒活性减弱或影响病毒对细胞的黏附，但目前尚无人探究姜黄素对猪圆环病毒2型复制的影响，本实验结果可以为猪场养殖中降低PCV2发病率提供一种方法。

5. 研究计划与进展

研究计划

2018.9-2018.10 分离纯化猪圆环病毒2型毒株

2018.10-2018.11 mtt法检测姜黄素对感染pcv2细胞活力的影响