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1. 研究目的与意义

杨树是我国短周期工业用材林首选树种，其特点是生物量大、生长周期短、用途广。现阶段，杨树产业发展尤为突出，它在改善生态环境，发展区域经济，增加农民收入等方面发挥了重要作用。发育生物学研究结果表明，杨树作为研究硬材木质部形成的模式植物具有巨大优越性：杨树基因组测序已经完成，而且它的基因组相对较小，有大量的表达序列标签(ESTs)存在，比较容易转化，有利于研究其基因功能。因此杨树是研究维管植物解剖学构造、生态学特性、形态分化与发育，以及结构与功能相关性的合适材料。所以，研究杨树叶肉细胞分离与活力保存,对于植物发育生物学的理论研究及实践具有重要意义。

本研究以南林895杨为实验材料，通过分离叶肉细胞，建立游离叶肉细胞悬浮培养系，研究不同培养条件下叶肉细胞分离机活力保存效果，有效地解决悬浮培养细胞的分离培养问题，为林木体外管状分子培养及其分化机理的研究提供理想的实验平台。

2. 国内外研究现状分析

近年来，利用植物单细胞进行植物生理、生化和遗传修饰等的研究日益增多。高等植物的单细胞可以像细菌、真菌一样提供一种优良的实验系统，但一般来说，进行细胞分离时，直接用酶法或非酶方法从器官、组织游离下来的多是数种细胞的混合物。为了从细胞水平研究生物体的结构、组成、代谢等生物学问题，往往需要从器官、组织中分离得到大量的同类细胞，而且要求这些细胞要有较高的纯度和活力。更为特别的是，如果要进行细胞功能方面的研究，必须在研究之前将所需的特定细胞从其自然环境中分离纯化出来。所以，单细胞的分离获取是植物发育生物学研究经常涉及的问题。通常获得植物游离单细胞的方法主要有外植体分离法、愈伤组织诱导法和原生质体再生法。

自1958年steward等人首次由胡萝卜细胞悬浮培养经体细胞胚胎发生途径获得完整的再生植株以来，细胞悬浮培养技术得到深入的研究和广泛的应用。近年来，一些科学家将植物细胞悬浮培养这一技术应用于作物的改良，使人们认识到要获得遗传的多样性，悬浮培养技术确实是一个新的手段。多年来研究材料已经由胡萝卜、烟草到木本林木类植物。胚性悬浮细胞系还是获得多种植物原生质体再生的最好来源，原生质体再生植株特别是转化后的原生质体再生植株非常困难。目前，利用胚性悬浮系己成功诱导出作物、林木，药用植物等多个品种原生质体再生植株。最近，果树悬浮细胞培养与植株再生的研究也获得成功，例如魏岳荣等（2005）建立了贡蕉[musaacuminatacv.mas（aa）]的胚性细胞悬浮系，并且诱导其植株再生。2007年，荔枝（litchichinensis）胚性悬浮细胞系的建立及其体胚植株再生的文章也被报道。随着基因枪的诞生，用悬浮细胞直接进行基因转化也成为了现实。悬浮培养还是单细胞培养的最主要方式，悬浮系的对数生长期细胞分裂旺盛、增殖较快，是分离单细胞的最佳时期。近年来，许多品种的植物已经通过悬浮培养成功地进行单细胞的分离和培养，利用植物细胞悬浮培养培养技术生产有用代谢产物，已经成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域，而以培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究又成为这一领域的新热点。同时,植物悬浮细胞培养也为快速、有效的诱导抗性植株，进行高产细胞株的筛选和稳定性研究，实现大规模扩繁和人工种子的生产提供了更为有效的途径。

管状分子（trachearyelement，tes）是高度特化的细胞，在形态结构、生化和分子组成、发育及生理功能上都具有明显的特点，一直是植物解剖学、发育生物学和细胞生物学的研究热点之一。管状分子包括导管和管胞两种类型，导管经端壁分化形成穿孔板再融合构成导管，管胞则通过细胞壁上的纹孔进行细胞间物质的转运，从而实现植物体内横向、纵向运输水分与矿物质的功能以及机械支撑等重要作用。

3. 研究的基本内容与计划

（一）研究内容

1.酶解法游离叶肉细胞

酶解方法：在超净工作台上取42d苗龄南林895杨试管苗上部（1-4）完全伸展的叶片8-10枚，并称重。用解剖剪除去主脉，剪成2mm左右的细条，放入盛有15ml过滤灭菌酶解液的三角瓶中，密封后在252℃，50r/min摇床黑暗酶解6h。6h后将酶解液用200目不锈钢网筛过滤，去除未酶解的组织残渣。取滤液500r/min，离心3min，小心去除上清液，在离心管中加入新鲜洗液清洗两次，将沉淀的叶肉细胞悬浮于1ml洗液中。

酶解液的配制：称取0.04g、0.08g、0.12g离析酶，用10mlCPW盐溶液充分搅拌溶解，加入0.182g甘露醇（0.1mol/L），调节pH值为5.0，设置浓度为0.4、0.8、1.2%的离析酶解离液；称取0.008g、0.012g、0.015g果胶酶，溶于10mlCPW盐溶液，加入0.182g甘露醇（0.1mol/L），调节pH值为3.5，配置成浓度0.08、0.12、0.15%的果胶酶解离液；称取0.001g、0.002g、0.005g纤维素酶，溶于10mlCPW盐溶液，加入0.182g甘露醇（0.1mol/L），调节pH值为7.0，配置成浓度0.01、0.02、0.03%的纤维素酶解离液，过滤灭菌后备用。注意酶解液必须现用现配，以防分解失效。

洗液的配制：附加0.1mol/L甘露醇的CPW盐溶液，调节pH至5.5，此时细胞既不发生质壁分离又不膨胀破裂。

以南林895杨叶片为材料，研究酶种类与浓度、酶解时间等因素对叶肉细胞酶解效果的影响。

1.1酶种类及其浓度对叶肉细胞分离的影响

1.1.1离析酶

根据试验方法，用离析酶进行单因素试验，选用适宜浓度的甘露醇调节渗透压。离析酶酶解叶肉细胞的产量及活力测定结果见表2。

表2、酶解法分离叶肉细胞单因素试验

1.1.2果胶酶

根据试验方法，用果胶酶进行单因素试验，选用适宜浓度的甘露醇调节渗透压。果胶酶酶解叶肉细胞的产量及活力测定结果见表3。

表3、酶解法分离叶肉细胞单因素试验

1.1.3离析酶 果胶酶

根据试验方法，用离析酶和纤维素酶进行两因素完全试验。两种酶液结合使用，叶肉细胞的产量及活力测定结果见表4。

表4、酶解法分离叶肉细胞两因素完全试验

1.1.4离析酶 纤维素酶 果胶酶

根据试验方法，用离析酶、纤维素酶和果胶酶进行三因素正交试验。三种酶液组合叶肉细胞的产量及活力测定结果见表5。

表5、酶解法分离叶肉细胞三因素正交试验

根据极差分析，得出三种酶分离叶肉细胞的影响力排序。对原始数据进行方差分析，观察三种酶各个水平间是否达到显著差异或极显著差异，如果不存在显著差异，基于经济成本，采取最低浓度水平；如果存在极显著差异，需进一步采用最小显著差异法对该种酶各水平叶肉细胞产量进行多重比较，得出效果最好的酶浓度水平。

根据上述三次试验，综合比较叶肉细胞的产量和活力，得出分离叶肉细胞的最佳酶浓度组合。用筛选出的最优酶类组合的酶液进行验证试验。

1.2酶解时间对叶肉细胞分离的影响

采用筛选出的最佳酶液，对南林895杨叶片分别进行2,4,6,8,10,12h的酶解处理，不同酶解时间下叶肉细胞的产量及活力测定结果见表6。

表6、酶解时间对叶肉细胞分离的影响

由上表得出最佳酶解时间。

2．机械法游离叶肉细胞

机械法操作流程：取大小均等无菌苗叶片8-10枚，除去叶片主脉；将叶片剪成2mm2小块，随后转移至研钵；在研钵中添加3ml细胞培养液，轻微研磨、将滤液过滤至培养皿，；用移液枪将培养皿中滤液转移到10ml离心管中，不足10ml，添加至10ml，低速离心机1200r/min，1min；去除上清，沉淀细胞团清洗2次，纯化细胞；最后向细胞团添加1ml细胞培养液，取5μl制作临时装片观察细胞得率、细胞形态，利用血球计数板调节细胞密度。

2.1苗龄对叶肉细胞分离的影响

根据实验方法，对不同苗龄的南林895杨叶片进行研磨。选取苗龄为28d、35d、42d、49d、56d南林895杨组培苗幼嫩叶片为试验材料，将叶片除去主脉，尽量剪碎，在研钵中加入适量细胞洗液进行研磨，分离叶肉细胞。不同苗龄叶片叶肉细胞的产量及活力测定结果见表9。

表9、苗龄对叶肉细胞分离的影响

由上表得出最佳苗龄。

2.2叶片发育形态对叶肉细胞分离的影响

根据实验方法，除正常试管苗的叶片之外，再选用愈伤组织分化的不定芽上幼嫩叶片做试验材料，该形态下叶的幼嫩程度更高。研磨、过滤、离心后统计叶肉细胞的产量及活力，活力测定结果见表10。

表10、叶片发育形态对叶肉细胞分离的影响

3．南林895杨叶肉细胞转分化培养体系的构建

通过酶解法和机械法获得游离叶肉单细胞后需要采用一定的方法进行植物细胞培养，保持较高的细胞活力并使细胞不断生长分化。本实验以模式树种南林895杨组培苗的游离叶肉细胞作为试验材料，参考Fukuda百日草系统对南林895杨游离叶肉细胞进行悬浮培养，以建立硬材木材中管状分子分化的实验体系。

3.1基本培养基的选择

取用酶解法和机械法分离所得的叶肉细胞以105个/ml的初始密度培养于FK、D、S三种液体培养基中，制成细胞悬浮液，置于摇床上黑暗下培养，摇床转速为80rpm，培养温度25℃。每24h用吸管吸取摇匀后中间的悬浮液，将其纯化、染色，在荧光显微镜下观察细胞形态，看管状分子分化进程及比率，计算存活率。比较不同基础培养基成分对细胞活力的影响。FK、D、S培养基成分如下表11所示。

表11、南林895杨叶肉细胞转分化培养基组分表（单位μM）

3.2最佳起始密度的筛选

分离的单细胞用血球计数板调整密度，分别以102、103、104、105、106个/ml的初始密度在80rpm的摇床上25℃恒温黑暗培养。每24h取样制作临时装片在荧光显微镜下观察细胞形态，看管状分子分化进程及比率，做细胞活力测定，选择用于悬浮培养的最佳起始密度。

表12、细胞起始密度对南林895杨叶肉细胞转分化培养的影响

3.3选择最适宜的摇床转速

摇床转速悬浮系的建立有一定的影响，实验中设置摇床振荡速率速为60、80、100、120rpm，每24h取样制作临时装片在荧光显微镜下观察细胞形态，看管状分子分化进程及比率，做细胞活力测定，选择最佳摇床转速。

表13、摇床转速对南林895杨叶肉细胞转分化培养的影响

3.4最佳激素配比的筛选

植物激素及生长调节剂几乎都参与了管状分子的分化，通常认为生长素、细胞分裂是管状分子分化的基础性诱导因子，同时，芸苔素内酯是在分化的后期阶段发挥作用，管状分子形态建成之前芸苔素内酯生物合成途径的中间产物急剧增多，认为生长素、细胞分裂素、芸苔素内酯是管状分子分化过程中不可或缺的。在筛选出的基本培养基基础上，添加三种植物激素或生长调节剂，设计正交试验，通过管状分子分化进程及细胞活力，筛选游离叶肉细胞转分化过程中的最佳激素配比。

表14、生长素、细胞分裂素、芸苔素内酯三因素正交试验

（二）研究计划

1.阅读文献，查阅相关资料；建立杨树组培苗快繁体系，培育用于分离叶肉细胞的组培苗。

2.利用机械法和酶解法游离叶肉细胞，筛选保持细胞培养活力的最佳条件。

3.对杨树叶肉细胞进行悬浮培养，构建叶肉细胞转分化体系。研究不同的植物激素水平对

叶肉细胞转分化的影响，筛选适用于叶肉细胞转分化的最佳激素配比。

4.分析实验结果，如有必要，进行补充试验，以完善数据。

5.撰写论文。

4. 研究创新点

1.实验特色

本研究以南林895杨为实验材料，通过酶解法和机械法两种方法分离叶肉细胞，比较细胞数量和活力，建立游离叶肉细胞悬浮培养系，初步研究不同培养条件下叶肉细胞转分化效果，建立可重复、高分化率的杨树叶肉单细胞悬浮培养分化体系，为林木管状分子分化机理的研究提供理想的实验平台。

2.实验创新