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1. 研究目的与意义

杂交鹅掌楸是我国重要的用材树种，有着重要的经济和生态价值。但由于种子的短缺限制了苗木的供应，通过体胚发生获取优质的种苗是保障林业可持续发展的重要的手段。外植体在特定的条件下脱分化进行细胞重编程来关闭、开启一些基因表达来获得胚性能力。胚性能力的获得是一个复杂的过程，体细胞胚胎发生需要跨越的第一步。目前关于愈伤组织胚性获得的分子机制还不清楚。蛋白质组学是功能基因组学的一部分，愈伤胚性能力获得的蛋白质组学将为有助于全面了解胚性愈伤的蛋白质调控网络。蛋白质样品制备是蛋白质组学研究的第一步，且关键的一步。理想的蛋白质提取方法将可重复捕获、溶解给定样品中的蛋白质，并减少污染、人为的修饰及蛋白质降解。由于蛋白质样品多态性、复杂性及蛋白质翻译后修饰，因此没有一种蛋白质提取方法可以捕获所有植物样品的蛋白质组。优化和选择适合的提取方法将提供全面的蛋白质组信息

2. 国内外研究现状分析

杂交鹅掌楸不仅具有生长快，抗性强，材质好，而且树形美观，花色艳丽，是一种适用于庭院栽培，道路绿化，荒山荒地造林等多种用途的优良树种。但是尽管杂交鹅掌楸有许多优越性，但杂交制种受到季节限制，影响了杂交鹅掌楸的推广应用。由于植物体细胞胚胎发生和植株再生技术具有效率高，数量多的特点，一旦形成体细胞胚就能够快速发育成再生植株的特点，所以通过体细胞胚胎发生技术快速繁殖种子来源困难的杂交鹅掌楸，但是杂交鹅掌楸胚胎发生的机理研究起步较晚，有很多问题亟待解决。对于早期阶段和萌发期培养条件的忽视，使得这方面的研究信息较少；生理生化以及分子生物学方面的研究不多，很多机理仍然不清，对于蛋白质这一生命活动的直接参与者的研究更是少之又少。随着蛋白质组学技术的迅速发展和应用，运用该项技术开展杂交鹅掌楸胚胎发生研究具有十分重大的意义。

1.1体细胞胚胎发生调控研究现状

目前植物科学家关于控制体细胞胚胎发生的过程了解不多。关于植物体细胞胚胎发生过程的分子生物学的研究较多集中在拟南芥和胡萝卜。例如，最近的研究表明在拟南芥中一些特定基因的过量或低表达可促使体细胞胚胎发生[1]。pei1，胚胎特异锌指蛋白基因是拟南芥心型胚形成所需要的[2]；纤维素类合成酶(atcsla7)是拟南芥植物胚胎发生过程必要的信号分子[3]；胡萝卜体胚发生研究结果表明富含亮氨酸重复序列的类受体激酶的出现标志着体胚细胞形成胚胎[4]。朱长甫（1997）等研究表明ecp63基因在体细胞胚发生方面起着重要作用，是胡萝卜体胚细胞发生的一个分子标记。xiao et al.（2006）和郝玉金(2002)分别分析拟南芥突变体met1-6和脐橙突变体，结果表明dna甲基化在胚胎发生中起着重要的作用，并且参加基因表达调控进而影响着生长素的反应和胚性细胞的发育阶段[5]。serk在胡萝卜、鸭茅和拟南芥中的表达表明serk是胚胎发生细胞的一个很好的标记[6]。目前已鉴定出一些参与胚性能力建立的转录因子，除了干细胞调节基因wus参与体细胞胚性能力的获得，还有lec1, lec2, bbm和agl15参与体胚发生的诱导[7]。

3. 研究的基本内容与计划

蛋白质样品制备是蛋白质组学研究的第一步，关键的一步。由于不同植物组分各差异较大，且含有大量干扰物质如核酸、多糖、酚类物质，盐类等，到目前为止还没有一种提取方法适合所有植物[4, 5]。蛋白质提取过程中操作不精细或者所选取提取方法或裂解液不适合实验材料，都会造成一些蛋白的降解和低丰度蛋白的丢失，直接影响双向电泳结果及后续质谱分析。杂交鹅掌楸胚性愈伤组织及体胚材料杂质较多，体胚属于薄壁细胞，蛋白质本身含量低。样品成功地制备是鹅掌楸愈伤大规模蛋白组学研究的保证。本实验采用四种实验方案Mg/NP-40TCA/actone、TCA/actone、Lysis bufferclean up、Lysis bufferTCA/actone对杂交鹅掌楸胚性愈伤进行蛋白质提取、比较分析。

计划：蛋白质提取，SDS-PAGE，双向电泳

银染、蛋白质酶解、质谱分析

4. 研究创新点

特色：获取杂交鹅掌楸愈伤组织的最优提取方法