全文总字数：1414字

1. 研究目的与意义

d-乳酸是一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料，利用改为生物代谢廉价底物，高效合成具有极高光学纯度和极高化学纯度的d-乳酸，是实现其工业应用的基本要素。

大肠杆菌可以作为d-乳酸合成的重要微生物，但野生型菌株进行d-乳酸发酵合成时，发酵液中副产物含量较高、乳酸转化率和合成速率低，必须通过有效代谢途径的改造或修饰，以提高d-乳酸发酵生产的化学纯度。

本论文利用基因工程和代谢工程原理与技术，应用red重组系统和xer重组系统对野生大肠杆菌（w3110）乳酸合成相关竞争途径中酶基因的进行删除，以期获得能高效利用木糖产d-乳酸的大肠杆菌代谢工程菌。

2. 国内外研究现状分析

来自弗罗里达大学的zhou^[20]等通过删除基因frdbc (编码富马酸还原酶)、adhe (编码乙醇脱氢酶)、pflb (编码甲酸裂解酶)阻断了d-乳酸竞争途径，抑制了琥珀酸、乙醇、甲酸和乙酸的积累量，在无机盐培养基中发酵168 h合成48 g/l的d-乳酸，化学纯度达98%，在此基础上删除基因acka (编码乙酸激酶)导致乙酸的积累量进一步减少，乳酸合成速度加快。

zhu^[21]等构建具有frdabcd、pps (编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶)、aceef (编码丙酮酸脱氢酶)、pfl、poxb (编码丙酮酸氧化酶)基因突变的重组e. coli以乙酸盐作为碳源进行好氧菌体生长，再以葡萄糖为碳源进行严格厌氧发酵，乳酸产量高达138 g/l，转化率达97%。

具有acka、pta (磷酸乙酰转移酶)、pps、pfl、dld (d-乳酸氧化酶)、poxb、adhe、frda基因突变的菌株e. colib0013-070，与原始菌相比乙酸、琥珀酸、甲酸和乙醇的含量分别降低了95%、89%、100%和93%。

3. 研究的基本内容与计划

3.1研究内容

① 大肠杆菌中心代谢途径的多个基因的确定及相关引物设计

删除基因：丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflb），丙酮酸氧化酶基因（poxb），富马酸还原酶基因（frda）。

4. 研究创新点

大肠杆菌自身具有 Xer 重组酶系，能够识别 dif 位点，因此在基因删除过程中用Xer-dif 重组系统代替FLP-FRT 重组系统，可省去外源 FLP 重组酶系(如质粒 PCP20)的转化与去除的过程；尤其是在连续删除多个基因时，编码 Red 重组系统的辅助质粒可始终保留在菌株中，省去Red和FLP重组系统的反复转化和去除的过程，可以显著减少实验的工作量。然而，至今运用 Red 重组系统-Xer 重组系统进行基因删除的研究较少。

本文主要以敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌W3110为起始菌株，利用Red 重组系统实现突变基因盒在大肠杆菌基因组中的高效率重组，再利用自身的Xer重组系统实现靶基因突变后选择性标记高效删除。由此，可进行以大肠杆菌基因组为背景的多位点、多基因删除，方法简便，重组效率高，所获得的突变菌株染色体上无抗生素标记痕迹。