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1. 研究目的与意义

d-塔格糖作为稀有糖的一种，由于其具有甜度高（蔗糖的92%），口感、加工性质与蔗糖相似等优点而成为功能性甜味剂[1]研究的新成员。

作为一种新型的功能性甜味剂，d-塔格糖在食品、保健、医疗领域中均具有重要的应用价值。

经过二十多年的研究已经发现了许多能够生产塔格糖的方法总的来说可以分为两大类：化学法和生物法。

2. 国内外研究现状分析

1993年，cheetham[6] 等发现l-阿拉伯糖异构酶( l-arabinose isomerase，简称l-ai 酶，ec5. 3. 1. 4) 能够催化d-半乳糖生成d-塔格糖; 此后的20 年间，通过对不同种类的微生物进行产酶筛选、外源表达和性质表征，学者们已经找到了多种适合d-塔格糖工业化生产的l-ai 酶; 且发现主要具有对d-半乳糖的转化率高、酶的热稳定性好、酶的最适催化ph 偏向于适合工业化生产的酸性条件( ph 在5. 0 ～ 6. 0 之间) 等特点[7]。

而在lai的蛋白质工程研究中，kim[8]等通过errorprone pcr获得的源自geobacillus stearothermophilus l-ai三点突变酶(m322v、t393a和v408a)，其最适反应温度从野生型的60℃提高到65℃，在70℃时其活性是野生型的3．64倍。

由此可见突变酶的最适反应温度和热稳定性都得到了显著提高。

3. 研究的基本内容与计划

（1）掌握实验必须的分析方法（fplc纯化蛋白、阿拉伯糖异构酶酶活测定）；（2）进行单点突变（phe279、met185、met349突变为ala），测定突变酶的酶活；（3）从phe279、met185、met349中挑选最优突变位点，进行饱和突变，筛选突变酶；（4）纯化突变酶，测定酶学性质及动力学常数。

实验数据采集与处理要求养成及时记录实验报告的良好习惯，以真实实验为基础,将实验数据采集之后交由计算机分析处理,做到实验数据不仅真实可靠，而且清晰、明确。

结果分析要求论证逻辑紧密，概念准确。

4. 研究创新点

来源于本实验持有菌株bacillus coagulans s44 l-阿拉伯糖异构酶基因，并证实该基因编码的 l-阿拉伯糖异构酶具有催化 d-半乳糖转换为 d-塔格糖的能力。

通过对bacillus coagulans s44 l-阿拉伯糖异构酶结构的分析和活性中心的预测，首次从底物的亲和力方面对 l-阿拉伯糖异构酶进行分子改造，提高 l-阿拉伯糖异构酶对相对大分子底物 d-半乳糖的催化能力。