1. 研究目的与意义

菊粉酶（inulinase）是一种催化裂解菊粉（inulin）中β-2,1糖苷键的水解酶，产物多为果糖和低聚果糖[1]。前期实验中，从无花果曲霉中提取出内切菊粉酶基因，再以大片段基因为模板扩增基因片段。利用扩增产物片段与peasy-blunt载体连接，构建了在大肠杆菌中复制的peasy-blunt-inu重组载体。利用限制性内切酶切重组blunt-inu载体和ppicαa载体，得到有相同粘性末端的inu片段和线性的，ppicαa利用连接酶将两片段连接，构建了能在大肠杆菌和毕赤酵母中复制表达的穿梭质粒ppicαa-inu。

论文第二部分是将线性化的ppicαa-inu载体通过电转化的方法转移至毕赤

酵母中，利用载体基因与毕赤酵母染色体上5'aox基因的同源性，将其同源重组。pcr验证阳性转化子。实验利用甲醇作为唯一碳源和诱导剂，诱导转化子表达重组菊粉酶蛋白。浓缩发酵液上清中的蛋白，利用sds-page电泳检测发酵液中蛋白表达情况，实验结果显示，转化子能大量表达重组酶蛋白，并利用载体自身的信号肽将蛋白分泌到细胞外。利用dns方法检测重组酶活性，摇瓶发酵转化子产酶量不断提高，在120h酶活性达到峰值，达到14.34u/ml，将本实验从基因工程手段和重组蛋白表达两方面研究菊粉酶基因inu在毕赤酵母中的表达。

2. 国内外研究现状分析

见附件。

3. 研究的基本内容与计划

（1）查阅国内外相关资料

（2）从无花果曲霉内提取内切菊粉酶基因

（3）以内切菊粉酶基因组为模板，扩增基因片段

4. 研究创新点

利用扩增产物片段与pEASY-Blunt载体连接，构建了在大肠杆菌中复制的PEASY-Blunt-Inu重组载体。利用限制性内切酶切重组Blunt-Inu载体和pPICαA载体，得到有相同粘性末端的Inu片段和线性的，pPICαA利用连接酶将两片段连接，构建了能在大肠杆菌和毕赤酵母中复制表达的穿梭质粒pPICαA-Inu。将线性化的pPICαA-Inu载体通过电转化的方法转移至毕赤酵母中，利用载体基因与毕赤酵母染色体上5'AOX基因的同源性，将其同源重组。