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1. 研究目的与意义

研究目的：熟悉菊粉酶酶学性质。掌握基本实验操作：果糖标方测定；菊粉酶活测定；发酵实验注意事项等。熟悉产酶流程。掌握菊粉酶发酵条件的优化和菊粉在无花果曲霉和保加利亚乳杆菌同步糖化发酵下产D-乳酸实验。

研究意义：菊粉具有产量高，加工转化容易，价格低的特点，可作为新的廉价糖源及功能食品加以开发，在替代粮食原料方面具有重要意义。

2. 国内外研究现状分析

1.前言许多菊科植物中含有丰富的菊粉（又称菊糖，inulin）,是一种贮存性的多糖类物质,广泛存在于一些菊科植物中,如菊芋、菊苣、大丽花、牛蒡等。菊芋的适应性强,在我国云南、贵州、广西以及北方多个省份均有种植,产量高,耐贫瘠,价格低,可作为新的廉价糖源及功能食品加以开发,但目前尚未得到很好的利用[1]。菊粉酶(inulinase)是一种催化水解菊粉中β-2,1-呋喃果糖苷键的水解酶。根据对底物的作用方式,可将其分为2类:一类是外切型菊粉酶(exoinulinase),多数微生物来源的菊粉酶属于此类。另一类是内切型菊粉酶(endoinulinase),常分离自真菌,如无花果曲霉( Aspergillus ficuum )、粗褶金孢子菌(Chrysosporium pannorum)等[1]。菊粉酶用于果糖、果葡糖浆和低聚果糖的生产，菊粉酶还可直接发酵菊粉制备各种产品,如:乙醇、丙酮丁醇。也可用于诊断肾脏疾病。目前,菊粉酶的生产,传统方法一般采用液态发酵。近年来,也有学者报道使用固态发酵法[2]生产菊粉酶。无花果曲霉菌落生长较快,培养9d其直径为6cm,绒状,表面呈黑色,具放射状沟纹,背面中央为褐黑色,四周无色,分生孢子头球形,后裂成几个放射的柱状物,大者直径约400μm,小者仅为140μm,黑色,分生孢子梗壁厚,无色至淡褐色,光滑,730~1200μm12~20μm,顶囊球形或近球形。一般直径为36μm~52μm,小梗双层,自顶囊全面着生,梗基一般为511~10.2μm2.8~4μm,小梗6.4~13μm1.8~2.6μm,分生孢子球形或近球形,直径一般为2.6~4.9μm,部分呈卵形13.8~5.1μm3.3~4.1μm[3],孢子表面粗糙。本课题主要是利用无花果曲霉发酵产菊粉酶，所以就此展开讨论。

2.文献综述2.1菊粉酶菊粉酶(inulinase)是能够水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶,学名β-2,1-D-果聚糖酶,又叫β-果聚糖酶、2,1-D-果聚糖水解酶(EC 3.2.1)。分泌菊粉酶的微生物在自然界中分布很广,土壤、水和动物消化道中的多种微生物都能分泌。菊粉酶可以在一定的温度条件下水解菊粉成果糖或低聚果糖。菊粉酶有不同的分类方法。根据菊粉酶在微生物体内主要分布于细胞内、细胞壁和细胞外,分别称为胞内酶、胞壁结合酶和胞外酶；根据作用底物方式的不同,或者说根据菊粉酶酶切果聚糖链方式分为内切酶(EC3.2.1.7)和外切酶(EC3.2.1.80)，内切菊粉酶水解菊粉可以得到高纯度低聚果糖,常由真菌分离出来，外切菊粉酶在胞内、胞壁、胞外都有分布,它水解菊粉可以得到高纯度果糖；根据来源菊粉酶可以分为微生物菊粉酶和植物菊粉酶。菊粉酶的性质：菊粉酶具有良好的热稳定性，绝大多数报道中,菊粉酶的最适温度为52~64℃之间,55~58℃最适宜；菊粉酶最适pH为弱酸性,这一性质不仅操作安全,而且使用过程中可以防止微生物污染,也是果糖最稳定的pH值；菊粉酶还具有底物专一性，研究[4]发现一定浓度的菊粉、麦芽糖和低浓度的果糖能够诱导生成菊粉酶,淀粉对菊粉酶的影响不大,葡萄糖却能明显地抑制菊粉酶活性,这表明菊粉酶有底物专一性。2.2菊粉酶的发酵生产2.2.1产菊粉酶的微生物产菊粉酶的菌种一般是从腐烂的菊芋或菊苣的根际土壤中分离并利用以菊粉为唯一碳源的分离培养基分离筛选得到的。据不完全统计[5],产菊粉酶的丝状真菌有17个属40余种,酵母菌有10个属20余种,细菌有12个属10余种。研究表明[6]菊粉酶在微生物中的分布主要集中在酵母和霉菌上,细菌、防线菌报道的较少。曾报道过的有节杆菌(Atrobacter sp),假单孢菌(Pseudomonas sp),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，链霉菌(streplmyces)和梭状芽孢杆菌(Clostridium hertmosuccinigenes)等。酵母菌中研究最多的有脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis),马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)，酿酒酵母(Saccharomyces marxianus),假丝酵母(Candida)，德巴利酵母属(Debaromyces)等。霉菌有黑曲霉(Aspergillus niger)，无花果曲霉(A.ficuum),青霉(Penicillium sp),尖链孢霉(Fusarium oxysporum)，木霉(Trichoderma)等。2.2.2菊粉酶的发酵条件筛选出来的野生菌株往往酶活力低,稳定性差,酶产量低。因此,需对野生菌株采用不同的理化因子进行诱变以筛选出优良的生产菌株。酶的发酵生产是以得到大量所需酶为目的的,除了选择性能优良的产酶菌株外,还必须优化菌株的发酵条件。菌株在生长、繁殖和发酵阶段所要求的培养条件往往有所不同。所以,在设计和配制培养基时不仅要考虑各组分的组成、pH值以及培养温度,而且还要考虑发酵过程中营养组分的变化、pH变化、通气条件、发酵时间等诸多因素。产菊粉酶的菌株都具有较宽的碳源谱,能利用大部分的糖。许多研究表明[5],以菊粉作碳源比以其他糖作碳源的酶活力普遍都要高。淀粉、葡萄糖等无诱导作用,而一定浓度的菊粉的存在,对菊粉酶的合成有显著诱导作用,低浓度的果糖代替菊粉也有一定的效果。许多实验表明[7],采用菊芋、菊芋提取液作为发酵培养基的碳源,比以高聚合度的纯菊粉为碳源,其产酶活性更高。在不同的培养条件下,对于不同菌株,氮源的影响也不同"多数研究认为无机氮以(NH4)2HPO4和(NH4)H2PO4最好,(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3和KNO3也能促进产酶量的提高；有机氮以蛋白胨和玉米浆较好。培养基的pH与细胞的生长繁殖及发酵产酶密切相关。一般来说,细胞发酵产酶的最适pH值通常接近与该酶反应的最适pH值。但是,由于菊粉酶在酶反应的最适pH值条件下,细胞受到影响,故细胞的产酶最适pH值与酶作用的最适pH值有明显差异，同时,不同种类菌体对pH值要求也不会完全相同,并且培养基的pH值在细胞生长繁殖和代谢物产生过程中往往会发生变化,故必须进行必要的调节和控制。金属离子对菊粉酶活性的影响因研究条件不同而有不同。比较一致的结论[7]是:Zn2 、Mg2 、Cu2 、Mo2 、Fe2 对酶的合成均无明显影响,Ca2 有一定激活作用,而Cu2 、Ag 、Hg2 对酶活性有明显的抑制作用。温度也是影响菌体繁殖和酶产量的重要因素。不同菌体生长的最适温度和产酶的最适温度有所差异,在最适温度条件下,才表现出最好的效果。同时,同一菌体的生长和产酶的最适温度也并不一定一致,所以,针对同一菌株在进行发酵生产时,要在不同阶段控制温度条件,在生长繁殖阶段内控制在生长最适范围内,以利于细胞生长繁殖;而在产酶阶段,则需控制在产酶最适温度。发酵时间的长短对菊粉酶的合成及分布有很大影响。一般来说[5],菊粉酶在菌体的生长对数期尚未大量合成,而进入稳定期以后才开始大量合成,酶的合成与生长速率呈负相关。2.2.3菊粉酶发酵诱导物 在液态发酵法制备菊粉酶实验中，菊粉是底物和诱导物。诱导物是无论在正调控系统还是在负调控系统中，操纵子的开启与关闭均受到环境因子的诱导，这种因子能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变其对基因转录的影响，因此也称这种因子为效应物，凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物。目前，多数人[8]认为菊粉酶是一种诱导酶，葡萄糖、果糖为碳源时酶活力较低, 而菊粉则可显著提高酶活力，这可能是因为菊芋中不但有含量较高的菊粉, 还含有许多粗纤维、其他碳水化合物和一些矿物质的离子, 这些物质都为菊粉酶的产生提供了其他的营养物质。碳源是影响微生物产酶的主要因素。因为碳源在酶制剂生产中的作用十分复杂，一方面它是合成酶碳架及能量、构成菌体的主要来源；另一方面，它通常还具有诱导或阻遏酶产生的作用[9,10]。在试验中，碳源不仅仅作为无花果曲霉发酵产菊粉酶的营养物质，同是也是诱导无花果曲霉产菊粉酶的诱导物。试验中常用的诱导物有菊粉，蔗糖，葡萄糖、蔗糖酯、果糖、乳糖和玉米淀粉。实验时以碳源酶变量，其他发酵条件相同进行发酵，通过测定菊粉酶酶活确定最佳碳源。除碳源对菊粉酶合成有诱导作用外，金属离子也有相同的作用。金属离子[9]及其对应的阴离子，有的是酶活性部位的组成部分，有的是细胞物质的组成部分，或是酶的活化剂，它们是微生物生长必不可少的物质，同时也可促进或阻遏酶的合成。添加 NaCl 的酶活力稍高，添加CaCl2的酶活力稍低，金属离子中，Zn2 对菌种产菊粉酶激活作用最大，Fe2 稍优于Cu2 和 Mg2 ，而Fe2 则对菌种产菊粉酶有遏制作用，因此，在无机盐和金属离子方面选择 NaCl、ZnSO4、FeSO4。2.3菊粉酶的应用现状2.3.1生产果糖果糖是自然界中高甜度的天然甜味剂，甜度比蔗糖和山梨醇分别高80%和50%，同时果糖还具有比葡萄糖、蔗糖明显优越的保健与营养功效：在口感上，温度越低感觉越甜，特别适合应用于冷食，使产品质地更加细腻柔软；渗透压高，抑制微生物生长，延长食品保存期；保湿型好，可防止食品表面干涸，保持产品质地松软、着色性好，赋予烘烤食品良好的色泽；人体吸收不影响胰岛素水平和血糖值，可作为糖尿病人的甜味剂；缓慢释放能量，不产生乳酸，增加人体耐力，是运动员特定甜味剂。果糖可通过葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构法生产，也可通过菊粉酶水解菊糖生产。Thonart. D等[11]采用固定化菊粉酶的方法水解菊芋提取液制备果糖，克服了吸附法和共价法固定化酶的缺点，相结合进行，从而克服了以上两种方法的缺点，取得了较好的效果，并对果糖、葡萄糖进行了分离，果糖浓度可达 95%。2.3.2生产高果糖浆由于高果糖浆价格低廉,味甜、爽口,渗透压高,保藏效果好,所以已成为美、日等国的主要甜味剂。果糖甜度高,风味好,热值低,不易造成龋齿,糖尿病患者也可利用,所以被广泛用于食品和医药工业。70年代以来,以淀粉为原料,经糖化及葡萄糖异构化已能大规模生产果葡糖浆。但此法酶促反应步骤多,转化率低,工艺复杂,成本高。此后,以廉价的菊粉为原料,以酸法和酶法水解制备果糖逐渐受到重视。酸法产量高,但色素重,副产物多,分离精制难。80年代,美国、法国、比利时、加拿大等国的科学家开始研究菊粉酶酶法制果糖,其工艺简单,转化率高,产物纯,果糖产量高,可直接生产超高果葡糖浆。据美国研究,1hm2菊芋可生产4.45t果糖[1]，由此可见菊粉酶在果糖及果葡糖浆的生产上具有巨大的工业应用潜力。2.3.3生产低聚果糖低聚果糖是功能性低聚糖的一种，其主要的生理功能是调节人体肠道微生态环境和激活相关免疫系统。低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维,有防治便秘、抑制肠内腐败物质形成、提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用,同时适于糖尿病人食用[4]。研究表明，菊糖经内切菊粉酶定向水解后可制得低聚果糖。自然界中大多数微生物所产菊粉酶为由内切菊粉酶和外切菊粉酶组成的混合酶，且多数表现高外切酶活性，其水解菊糖的产物以果糖为主。因此，筛选低外切酶活力的菊粉酶生产菌株、或寻找菊糖水解过程中抑制外切酶活力的方法、或开发适合工业化规模的菊粉酶外切酶拆分方法将是利用菊糖生产低聚果糖的关键。目前，工业化生产低聚果糖的方法有两种。一是蔗糖经果糖转移酶催化制备，产物低聚果糖为GFn型；二是利用菊粉酶定向水解菊糖制备，产物低聚果糖为GFn与Fm的混合型[11]。在果糖转移酶催化蔗糖制备低聚果糖中，反应副产物葡萄糖是酶的抑制剂，转化率低，产物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖仅占55～60%以下，且工艺复杂成本高。菊粉酶定向水解菊糖制备低聚果糖是一步单酶反应，工艺简单，产物中低聚果糖含量高达80％以上。因此，以菊芋为原料酶法一步水解其中的菊糖制取低聚果糖，具有工艺简单、转化率高、副产物少的特点。比利时ORAPTI公司投资20亿比利时法郎，历时 10 年大规模种植菊芋，专门用于开发生产低聚果糖和菊糖。荷兰、日本等地也有大面积的菊芋种植基地，用于低聚果糖的生产。2.3.4生产乙醇随着人类社会工业化进程的加快和对以石油为代表的化石资源的过度开采，人类社会面临着全球气候变暖、资源和能源短缺、环境恶化等严重问题，其中近年来能源问题尤为突出。寻找可再生的替代资源和能源已成为人类社会目前和未来很长一段时期内的重要任务，以乙醇为代表的生物质能源技术的开发是其中的一项重要内容。传统乙醇的生产主要以粮食为代表的淀粉质原料生产，而从全球范围看，人类社会粮食生产、供应形势依然严峻，依赖粮食原料生产乙醇不可能满足巨大的燃料市场对乙醇的需求，因此，利用地球上丰富的非粮原料生产乙醇是未来该领域努力的方向。可用于乙醇生产的非粮原料主要包括:（1）非粮淀粉原料，如木薯等；（2）纤维素原料，如农林废弃物、林业生产和木材加工剩余物、城市纤维垃圾等；（3）糖质原料，如甘蔗、甜高梁、菊芋等。在糖质原料中，甘蔗是一种很好的乙醇生产原料，以甘蔗为原料生产乙醇在巴西取得了很大的成功，但甘蔗生产受到气候和地域的限制，同时在我国目前食糖供应仍然依赖进口的情况下，不可能有多余的甘蔗用于乙醇的生产。甜高梁也是一种很好的乙醇生产原料，可利用相对瘠薄的土地种植，但甜高梁的储存问题和乙醇发酵技术问题阻碍了甜高梁生产乙醇的工业化实施。菊芋是菊科多年生草本植物，耐贫瘠、耐干旱和耐盐，适应性强，可在我国北方缺水地区和东南沿海地区广泛种植，菊芋中的菊糖在酸或酶的作用下水解成果糖，继而可被微生物发酵成乙醇。因此，利用菊芋原料生产乙醇，也是我国发展生物乙醇的途径之一。国外从50年代开始利用菊芋生产乙醇的研究，80年代进行了大量工作，目前发酵菊芋生产乙醇的研究主要集中在菊粉酶高产菌株的筛选和适合工业生产的发酵工艺研究[11]。与先酸解或酶解菊糖，再发酵生产乙醇的两步法相比，利用某些菌株直接发酵菊糖生成乙醇的同步糖化发酵工艺，不仅省去了菊糖酸解或酶解的过程，降低了过程成本，而且同步糖化发酵可以降低或消除因菊糖水解产物的过度积累而对菊粉酶活力的抑制作用，有利于维持较高的生产强度，从而具有良好的工业化应用前景。2.3.5发酵乳酸乳酸是一种重要的有机酸，2001年，世界乳酸的总产量为13万吨，2002年超过20万吨，并逐年上升。全世界乳酸主要消费领域为食品工业，其次是医药，化妆品等。需要指出的是，国外以开发成功用乳酸为原料生产乳酸树脂-肠衣线、胶卷、双降解塑料技术，即将投入大规模推广阶段，另外各国聚乳酸的生产和应用开发，将为消灭PS白色污染产生划时代的影响，因此乳酸市场潜力巨大。乳酸的生产方法一般有发酵法、酶合成法和化学法三种。对菊粉资源的研究，国外始于上世纪70年代，主要研究利用微生物菊粉酶生产超高果糖浆和酒精发酵。在同步糖化与发酵(SSF)工艺[12]中，由于糖化与发酵同时进行，消除了高浓度的糖所引起的底物抑制现象，所以该工艺倍国内外广泛用于酒精生产。在菊粉发酵生产乳酸的工艺中同样存在明显的底物抑制现象，而且鉴于菊粉丰富的营养成分，SSF成为首选的乳酸发酵工艺。转化率偏低和容易染菌一直桎梏这生料发酵的工业化推广。而一定浓度的乳酸可以有效抑制杂菌的污染，所以在利用菊粉生产乳酸的生产工艺中，必须最大程度的提高乳酸发酵强度，使发酵液乳酸浓度在短时间达到抑制杂菌浓度以上，这就要求同时提高酶的糖化速率和乳酸发酵活力。提高发酵温度不但可以显著的增强菊粉酶的糖化活力，提高菊粉对乳酸的转化率，而且可以有效降低工艺的冷却成本。然而，提高发酵温度将加剧乳酸对细胞的酸胁迫，减弱细胞的代谢活性，从而降低细胞生长系数，不利于乳酸生产。所以，有必要对影响糖化和发酵速率的因子进行深入研究，建立适用于该工艺的动力学模型，从而确定SSF工艺的最佳条件。目前，我国乳酸发酵大多采用糖质或淀粉质为原料，这些原料主要来源于粮食作物，随着我国农业持续稳定的发展，我国幅员辽阔，乳酸生产所需的粮食原料如：大米、玉米等供应不足，因此尽快找到一种替代品成为当务之急。与目前人们普遍关注的以农作物秸秆为代表的木质纤维类生物质相比，菊粉具有产量高，加工转化容易等特点，更易于实现产业化。尤其重要的是，菊芋具有耐寒耐盐的特点，种植菊芋不仅不占用耕地，还能是我国数千万亩滩涂地和盐碱地得到开发利用，有利于环境保护。所以，利用菊粉酶发酵产乳酸，对我国农业发展具有重要意义。

3. 研究的基本内容与计划

3.研究内容和计划3.1 研究内容1.菊粉浓度对菌株af-98产菊粉酶的影响。

2.氮源及浓度对无花果曲霉产菊粉酶的影响。

3.接种量对无花果曲霉产菊粉酶的影响。

4. 研究创新点

以菊粉（替代粮食原料）为原料，无花果曲霉和保加利亚乳杆菌同步糖化发酵产D-乳酸，用同步糖化与发酵（SSF）工艺，很好的消除了 高浓度的糖所引起的底物抑制现象。