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1. 研究目的与意义

乳酸的分子式为CH3CH(OH)COOH，又名2-羟基丙酸，是一种重要的有机酸。L-乳酸及L-乳酸盐在食品、化妆品、医药、农业等领域有广泛的应用，聚乳酸可用于制造生物降解塑料，环保经济。利用可再生资源木质纤维原料生物炼制乳酸具有广泛的应用前景，而其结构与组成复杂，主要以葡萄糖基组成的纤维素结构致密，较难水解，以多种杂糖基组成的半纤维素，结构较松散，预处理可被水解成单糖。预处理过程中会产生多种抑制物，其种类及含量随纤维素原料性质及预处理条件的不同而不同，且更加增加了乳酸发酵的难度。本实验前期以凝结芽孢杆菌NL01为研究对象，以玉米秸秆为原料，利用等离子体诱变及菌种进行长期适应性进化获得了一系列耐稀酸水洗液的高抗逆菌株。本论文需对这些高抗逆菌株进行筛选以期获得最理想耐受水平的菌株，研究单一抑制物对于该菌株乳酸发酵的影响作用，发掘限制与水洗液乳酸发酵的关键性抑制物提出其抑制机理。最后考察该菌株利用不同预处理方式获得的水洗液发酵能力。

2. 国内外研究现状分析

木质纤维素原料预处理方法有物理法、化学法、生物法、物理化学法、生物化学法[1]。常用的物理法有剪切和研磨、高温分解、微波处理、液态高温水技术、高能辐射和超声波等。常用的物理化学法有蒸气爆破法、co2爆破法、蒸气爆破、氨纤维爆破与乙醇抽提结合法、超临界co2处理等。常用的化学法有酸水解法、湿氧化法、臭氧分解法、碱法、有机溶剂法等。主要有浓酸水解和稀酸水解2种。稀酸处理的优点是半纤维素水解得到的糖量大，催化剂成本低，易于中和。由于酸的浓度低，可以不必进行酸的回收。缺点是半纤维素水解产物五碳糖易在催化下进一步降解(糠醛)。由于稀酸水解有反应速率较快且能显著提高纤维素的酶解得率，并且过程廉价，是目前比较认可的预处理方法之一。

乳酸(lacticacid)的分子式为ch3ch(oh)cooh，又名2-羟基丙酸，是一种重要的有机酸，它作为原料、防腐剂、消毒剂、添加剂、调节剂等在酿造、食品、化妆品、医药等行业中发挥着重要作用[4]。乳酸具有旋光性，l-乳酸为右旋。l-乳酸分子内含有羟基和羧基，因此有自动酯化能力，脱水能聚合成聚l-乳酸。由于人体只含有l-乳酸脱氢酶，只能代谢利用l-乳酸，过多食用d-乳酸或dl-乳酸就会导致人体代谢功能的紊乱，危害人体健康。因此，从健康角度考虑，用l-乳酸代替目前在食品和医药工业中普遍使用的d-乳酸或dl-乳酸已是必然趋势。以l-乳酸为单体经化学合成的生物工程材料聚l-乳酸是一类高分子材料，无毒、无刺激性，可完全生物降解吸收，强度高，可塑性强而加工成型。

凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属。在国外已广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，但在我国关于凝结芽孢杆菌的研究和开发起步不久，而且发展缓慢[8]。凝结芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性乳酸生产菌，其由于发酵温度较高(≥50℃)，可以有效减少染菌的风险和倒罐几率，同时大大减少发酵过程中冷却水的使用，从而达到节约生产成本的目的[5]。是经美国fda批准的一种普遍认为安全的杆菌类乳酸菌。该菌株生长旺盛，芽孢产率高，乳酸产率高，并经中国药品生物制品检定所检定和批准使用。凝结芽孢杆菌tbc169菌株的芽孢对温度的耐受性强。凝结芽孢杆菌tbc169可以在室温保存，有效期可达24个月。凝结芽孢杆菌（bacilluscoagulans）cicimb1821是一株筛选获得的产l-乳酸的嗜热菌。该菌株在34～55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性，50℃时获得最高的比生长速率及最大的乳酸积累量。cicimb1821能在ph为5.0～7.5的范围内保持高菌体活性。氧气的存在利于cicimb1821的快速生长，但导致副产物的积累，而不通氧条件下该菌株也能良好生长，同时产酸速率可高达5.63g/l/h。控制残糖浓度不高于10％的发酵条件，发酵48h，可积累乳酸107.5g/l，副产物的总和仅为1.05g/l，葡萄糖对乳酸的得率为97.5％，所产l-乳酸光学纯度高于99％。此外，高浓度葡萄糖发酵实验显示，该菌株可于高渗透压下利用20％葡萄糖发酵生产l-乳酸，发酵100h后可积累乳酸134g/l，副产物总和仅得1.12g/l，葡萄糖产乳酸得率为92.0％[9]。本实验用野生型凝结芽孢杆菌菌株nl01为出发菌株，通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛，最终得到一株木糖耐受力强、l-乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株nl-cc-17。该突变菌株是目前已报道的木糖耐受力最高的菌株。当以100g/l的木糖为底物，50℃发酵72h后，l-乳酸产量达到82.30g/l，糖酸转化率为92.37%，l-乳酸产量较出发菌株提高21.51%，糖酸转化率提高了16.00%。通过初步优化发酵条件，确定该菌株最佳发酵温度为50℃，实验范围内最佳发酵ph值为5.5[3]。

3. 研究的基本内容与计划

本实验研究凝结芽孢杆菌发酵制乳中的抑制物耐受机制时，在发酵之前要先经过芽孢杆菌菌种的驯化，使其增强对抑制物的耐受程度，从而增加发酵过程中乳酸的产量。驯化过程是不断提高培养基的水洗液浓度，使菌株在逐渐增多的抑制物中进行摇床培养，提高菌株对抑制物的耐受性。前期以凝结芽孢杆菌nl01作为出发菌株，通过对抑制物形成、作用机制的了解，在合适的选择压力下对菌种进行驯化来达到对抑制物更耐受性。她将原始凝结芽孢杆菌在含有多种抑制物的稀酸预处理水洗液中进行驯化，菌种在经过分批培养后，进入一个连续培养系统中进行驯化，流加培养基中抑制物浓度逐渐上升，最后筛选出目的驯化菌株。与出发菌株相比，驯化菌株在含较低浓度稀酸水解液(66%)的培养基中有较高的糠醛和hmf转化率，同时，驯化菌株的乳酸得率提高。即菌株达到较高的抗逆性。使得高抗逆菌能利用不同预处理方式的玉米秸杆水洗液作为培养基进行发酵，比原始菌能制取更多的l-型乳酸。

通过探讨实验目的和方向，我们对实验做了初步设计：

1.建立实验必须的分析方法

4. 研究创新点

木糖的微生物发酵利用一直是木质纤维原料生物炼制领域的研究热点与难点。此外在木质纤维原料预处理过程中产生的抑制物，也更加增加了木糖发酵的难度。木糖生物转化技术的研究对于实现木质纤维原料高效利用，降低生产成本及提高资源利用水平均具有重要的意义。目前，预处理过程中抑制物对微生物发酵的抑制机理的研究多集中在少数几类菌株上，主要以酵母为首，关于凝结芽孢杆菌的不多。本课题意在提高木质纤维原料水洗液乳酸发酵能力的基础上重点研究不同抑制物对凝结芽孢杆菌乳酸发酵的影响机理。探讨该菌株发酵制取乳酸中抑制物耐受机制，并考察其利用不同预处理方式获得的水洗液发酵能力。这对于木质纤维原料水洗液高效利用和经济可行具有重要的意义。