全文总字数：2328字

1. 研究目的与意义

乳酸（lacticacid）又名α-羟基丙酸(α-hydroxypropionicacid)，因含一个不对称碳原子，分为D-乳酸和L-乳酸。由于人体只有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，L-乳酸作为食品添加剂等被广泛使用，加之L-乳酸在聚乳酸方面的应用，L-乳酸的高产菌选育及高效生产工艺已得到高度的发展与开发，而D-乳酸的研究则相对较少。D-乳酸作为一个重要的手性中间体，已被用于多种手性物质的合成。然而，目前我国存在乳制品发酵剂生产技术落后。传统人工型液态发酵剂存在的弊端，远远不能满足发酵乳制品工业的要求。以及进口发酵剂价格昂贵，增加了发酵乳制品生产成本的现状[1]。

保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)是一种被冠以国名的细菌，属于乳杆菌属乳酸杆菌亚属，是典型的来自乳的乳酸菌。保加利亚乳杆菌的发现已有100多年历史了。在培养中，保加利驱乳杆菌对碳源和氮源是有要求的，酵母膏是实验室常用的一种化学试剂，其中尼克酸、叶酸、钴胺酸含量较高，在中性及微酸性环境中对热稳定[2]。故酵母膏作为碳源、氮源对保加利亚乳杆菌有较显著的促进作用。另外，培养中缓冲盐也很重要，如CaCO3可以中和保加利亚乳杆菌代谢过程中产生的大量乳酸，解除代谢产物乳酸对菌体生长的抑制作用。一般来说，保加利亚乳杆菌耐受乳酸的最大量为2%，理论上乳酸菌经同型发酵途径每消耗lmol葡萄糖会转化生成2mol乳酸和2molATP，若产生2％乳酸需要消耗约2％葡萄糖，而总糖消耗量应为3％一4％或略高才能满足保加利亚乳杆菌的营养要求。该菌是乳酸菌中产酸能力最强的菌种，最高产酸量为2％，能利用葡萄糖、果糖、乳糖进行同型乳酸发酵产生D型乳酸(有酸涩味，适口性差)，发酵可产生香味物质[3]。

2. 国内外研究现状分析

2.1不同氮源类型对保加利亚乳杆菌d-乳酸发酵

王奎明等[4]对保加利亚乳杆菌高密度培养，把经过活化的菌种接人改良mrs，每3h进行1次活菌计数，同时测定发酵液的滴定酸度、ph值及od值，以便更准确地掌握其生长情况。实验主要使用了蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、硝酸铵和硫酸铵5种氮源，添加量1％。实验结果表明，使用牛肉膏时活菌数最高，选择牛肉膏作为最佳氮源。

李佳等[5]以lb5为试验菌株，根据lb5生物学特性和营养需求，对该菌体增菌培养基进行优化，为其菌体高密度培养确定适宜增殖培养基组成及有效的高密度发酵工艺条件，为保加利亚乳杆菌发酵剂的工业生产奠定良好基础。乳酸菌对氮源具有选择性，而保加利亚乳杆菌常用的氮源有大豆蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白胨、乳清粉，在单因素试验的基础上应该考虑通过正交试验设计配比不同的氮源，添加量选定5％。对这5种氮源进行活菌数试验。从结果看出，牛肉蛋白胨与酪蛋白胨和大豆蛋白胨酵母浸粉差异显著。氮源试验结果与氮源单因素试验相对应，与单因素试验是相一致的，大豆蛋白胨酵母浸粉酪蛋白胨空白，并最终选择大豆蛋白胨1.50％，酵母浸粉1.00％，酪蛋白胨0.25％。

3. 研究的基本内容与计划

以玉米浆干粉等为D-乳酸发酵的主要原料，不仅可以提高氮源的利用价值，而且可以降低D-乳酸的生产成本，同时可以充分利用原料，以减少浪费。本课题，首先研究了不同氮源类型与组成对D-乳酸发酵的影响。主要对酵母提取物、大豆蛋白胨、牛肉膏、玉米浆干粉、花生粕、大豆粕、硫酸铵和尿素几种不同原料进行研究，获得最佳的D-乳酸发酵原料，寻找廉价氮源减少D-乳酸发酵培养基中酵母提取物的用量以降低生产成本。其次是研究不同组分及比例的复合氮源的和微量维生素补充液对发酵效果的影响，主要保持保加利亚乳杆菌最适宜的生长温度、湿度、转速和装液量不变，从氮源的选择，氮源与微量维生素补充液等成分的配比入手进行研究。通过研究确定了最佳的氮源配比及最优的发酵条件，为今后工业生产提供了数据支持。

4. 研究创新点

目前，乳酸（2-hydroxypropionic，CH3CHOHCOOH）在食品、医药、化妆品和化工方面都有广泛的应用。在1995年发表的一篇文献中介绍说，在美国85%

的乳酸用于食品及食品相关工业，其新型的应用是生物可降解材料和生物相容性聚合物。随着这些生物聚合物的发展及商业化，其应用已经有相当大的增长。在2005年全球的乳酸有近30%用于这些新的应用方面[17]。而当前中国对D-乳酸的研究相对较少。如：白冬梅等[18]利用2,3,6-三甲基-β-环糊精作手性流动相添加剂，HPhypersilODS柱为固定相成功地分离了乳酸对映体。有NakaharaTadaatsu等[19]筛选的假单胞菌属，SP．TB-135菌株，Rajgar-hiaVineet等[20]利用基因工程的方法培养的克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，Hirayama，Shin等[21]从Sakito岛的海水中筛选的一株在厌氧及无光条件下自身发酵淀粉产D-乳酸的微藻类菌株Nannochlorumsp．26A4。总结前人有关发酵合成D-乳酸的研究工作，发现他们绝大部分工作集中于菌种筛选、发酵条件优化以及发酵工艺改进等方面，由于认识和研究手段的局限性，未能取得实质性的进展和突破。由于D-乳酸的研究开发滞后，国外仅有的少数几家企业对其进行垄断，同等级的D-乳酸价格比L-乳酸高5～10倍。因此，积极开展D-乳酸的发酵研究迫在眉睫。只有将分子生物学、代谢工程等现代生物技术手段相结合，寻找廉价氮源，同时继续开发高效率的乳酸发酵分离提取工艺，才能提高产量、降低成本。