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1. 研究目的与意义

植物根际有益微生物（生防菌、溶磷菌、解钾菌、根瘤菌等）一直面临着应用效果不稳定的问题，造成不稳定性的主要是因为这些有益微生物在不同条件下在作物根际的定殖能力有差异(李世贵等，2009)。大量研究表明：接种至土壤中的菌株能否在植物根部成功定殖对于其作用的稳定发挥至关重要。因此，准确的回收检测已经投放到环境中的微生物、研究这些微生物的定殖情况对于揭示有益细菌在根圈的微生态学特征、提高其根圈适应性和增产效果的稳定性等都具有具有十分重要的意义。

本研究拟采用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记的方法，对前期筛选到的高效溶磷荧光假单胞CLW17菌株在南方红豆杉根际的定殖动态和存活规律展开研究，旨在阐明溶磷细菌CLW17在南方红豆杉根际和菌根际的定殖变化规律，从而为后期开展的溶磷细菌与AM真菌互作对南方红豆杉的促生效应的研究提供理论依据。

2. 国内外研究现状分析

目前，国外已有大量成功应用GFP基因标记菌株进行微生物定殖研究的报道。Gage和 Bobo借助穿梭载体pTB93F在苜蓿根瘤菌里组成型表达GFP基因，并观察到根瘤菌侵染根系及根瘤形成的全过程。Bloemberg 等构建质粒 pSMC2，pGB3，pGB4，pGB5标记根际促生菌荧光假单胞菌（P. fluorenscent）WC5365，利用激光共聚焦显微镜可检测到 该菌株能在番茄幼苗的根表与表皮相邻的边界处形成微菌落。利用GFP标记的 P. fluorenscent 菌株 D-R54-BN14 接种生长在不同土壤中的燕麦植株，用激光共聚焦显微镜原位检测了标记菌在燕麦根际的定殖、生长与分布状况。构建 gfp-luxAB双标记系统，分别转化假单胞菌和大肠杆菌，接种土壤30 d后，检测GFP标记细胞仍有较高数量，但发光酶活性由于营养条件限制而缓慢下降。 用 pNOM102、携带潮霉素抗性载体pAN7-1及携带GFP基因载体 pTEFegfp 共转化生防木霉（Trichoderma harzianum）获得了同时携带3种标记基因的稳定转化子，转化菌株的形态学表型性状和生理特征与野生型并无明显差别，用激光共聚焦显微镜检测转化菌株在土壤中的活性和在作物根际的定殖。 Chelius 和 Triplett利用两个 GFP 标记的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneunoniae）菌株监测其在玉米幼苗上的定殖状况。

近年来，国内有关 GFP 在微生物根际定殖方面的研究报道有所增加。卢志军等^[以 GFP 基因标记根瘤菌 XJ83097，研究自然状态下G-XJ83097 在苜蓿根际的分布、定殖和动态变化。李金云等利用绿色荧光蛋白基因（GFP）标记示踪，研究了葡萄根癌病生防菌葡萄土壤杆菌 E26 菌株应用到田间后在玫瑰香葡萄根表面和根际土壤中的群体数量变化，比较了 E26 菌株与葡萄根癌病原菌 K308 菌株室内人工接种后在玫瑰香葡萄苗茎和根外植体伤口部位的附着情况，证实了生防菌 E26 能够和病原菌 K308 一样附着于葡萄根部伤口处。 邱珊莲等将 GFP 基因标记的甲基对硫磷降解菌 DLLBR 接入青菜根际土壤中，以激光共聚焦显微镜检测其在小青菜植株根部和植株内的定殖及分布，发现标记菌株在土壤中的存活力很高，与对照相比，更能促进植株内菌体结构的变化，为以后研究农药残留降解菌在土壤和植物中的降解过程和降解作用机制做了前期研究。张霞等构建了含有荧光假单胞菌自身启动子 Pp303的中间质粒载体pGFP，然后利用mini-Tn5转座子，通过接合转移将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基因分别整合到荧光假单胞菌 P303 染色体上，获得了在 488 nm 波长下发光稳定的 P303m1 和 P303m3 菌株，然后对绿色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌 P303 在大白菜根际的生存竞争和定殖能力进行了检测。结果证明，荧光假单胞菌在自然土壤中和大白菜根际都有较强的定殖能力。王浩等将绿色荧光蛋白转入高效、抗逆、广适应性的快生大豆根瘤菌 Sinorhizobium fredii CCB-AU 01287中，获得含 GFP基因的转基因菌株，用于实时监测根瘤菌在大豆根部的早期定殖情况和定殖密度的测定，研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖结瘤的情况。

3. 研究的基本内容与计划

1、2013.2.16―3.8：查阅文献，准备实验；

2、2013.3.9－3.15：溶磷荧光假单胞菌clw17感受态细胞的制备；

3、2013.3.16－4.1：gfp质粒的转化；

4. 研究创新点

本研究拟采用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记的方法，对前期筛选到的高效溶磷荧光假单胞CLW17菌株在南方红豆杉根际的定殖动态和存活规律展开研究，旨在阐明溶磷细菌CLW17在南方红豆杉根际和菌根际的定殖变化规律，从而为后期开展的溶磷细菌与AM真菌互作对南方红豆杉的促生效应的研究提供理论依据。