1. 研究目的与意义

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。

肽具有多样性，这是因为组成肽的氨基酸的种类不同、数量不同，肽的化学性质与功能都有所不同。肽具有显色反应，存在双缩脲反应，在强碱条件下与Cu2 形成紫色络合物，利用该特征反应，可广泛用于肽的含量测定。近年来肽类制品已不仅仅应用于药品、食品，已将它用来预防和阻止SARS病毒、艾滋病毒以及世界范围内蔓延的多种病毒。目前人们还在不断的发现，并且分离、纯化以及合成多肽类活性物质。总之，多肽物质的开发应用吸引着越来越多的研究者从事这方面工作。肽类药物有其自身的优点和缺点。其优点在于：肽类药物多数源于内源性肽或其他天然肽，因此，其结构清楚，作用机制明确；与多数一般有机小分子药物相比，肽类药物具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点；与蛋白类相比，较小的肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。其缺点在于：易降解、半衰期较短；生物利用度差；大多不能口服，一般为注射剂，需要研发适当的给药方式；大规模合成、分离纯化难度大；大肽具有免疫原性。随着分析仪器的现代化、定量与定性技术不断的进步，液相色谱（HPLC）、液质（LC-MS）联用技术在药物的代谢研究得到广泛应用。该方法灵敏度高，所需样品量少，同时具有直观性，为我们对蛋白质、多肽类药物的代谢研究提供了便利。

2. 课题关键问题和重难点

近年来，有关各种活性多肽的化学合成有了很大的发展，但产物成分比较复杂，一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物，因此，对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题，对其分离纯化的最优化研究也就显得格外重要。与多数一般有机小分子药物相比，肽类药物具有活性高、用药剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点；与蛋白类相比，较小的肽几乎没有免疫原性；可化学合成，产品纯度高，质量可控。但是，肽类药物易降解、半衰期较短；生物利用度差；大多不能口服，一般为注射剂，需要研发适当的给药方式；大规模合成、分离纯化难度大；大肽具有免疫原性。

科研人员可以根据肽类药物的这些特点，进行结构设计和化学修饰，充分发挥其优点，克服或避免其缺点，针对相应的适应证，达到研发的预期目标。蛋白质、多肽类药物浓度测定的经典方法有酶联免疫法、放射免疫法。随着分析仪器的现代化、定量与定性技术不断的进步，液质（lc-ms）联用技术在药物的代谢研究得到广泛应用。该方法灵敏度高，所需样品量少，同时具有直观性，尤其可快速测定代谢产物。

高效液相色谱法是在经典的液体柱色谱法基础上，引人气相色谱法的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，故被称做高效液相色谱法。反相色谱法是液相色谱的一种，反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，面以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相。

3. 国内外研究现状（文献综述）

（一）多肽

多肽是由蛋白质中20种氨基酸以不同组成和排列方式通过肽键(也称酰胺键)相互连接形成的化合物的总称。肽具有多样性，这是因为组成肽的氨基酸残基的种类不同、数量不同，肽的化学性质与功能都有所不同。肽具有显色反应，存在双缩脲反应，在强碱条件下与cu2 形成紫色络合物，利用该特征反应，可广泛用于肽的含量测定。

多肽广泛存在于自然界中，对多肽的研究和应用一直是科学研究的一个主要方向。生物活性多肽由于具有多种人体代谢和生理调节功能，且可作为药物或药物前体，食用安全性极高而广泛受到人们的关注，因此多肽的分离纯化也成了一个研究热点。随着分离纯化技术的进展，大大加快了新活性多肽的发现和合成速度。在多肽合成中，许多杂质显示与产物类似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得异常重要。

4. 研究方案

1、本课题的纯化分析方法是将固相合成的样品溶解，过滤，在制备液相色谱中梯度洗脱，多步分析纯化，最终得到纯度在99.5%以上的精品溶液。将溶液在旋转蒸发仪上旋去大部分有机溶剂和水分。然后将剩余溶液倒在干燥洁净的培养皿中，溶液约1元硬币厚，在培养皿上密封一层保鲜膜，用绣花针在保鲜膜上垂直扎一些密而细的针孔。将培养皿标记后，在冰箱中冷冻2h以上，再装在冷冻干燥机上冻干，冷冻干燥约24h，可去除99%以上的水分，最后在通风橱电子称上称量，得到粉末状固体。

2、（1）.溶液体系：流动相配置 0.1%tfa 1lh2o、0.3%hac 1lh2o、3.7g nh4ac 1lh2o、工业甲醇、工业乙腈、超纯水等。

（2）.粗品过滤时有机滤膜孔径为0.45μm，梯度洗脱时根据不同的流动相设置相应的洗脱梯度。

5. 工作计划

第1～2周： 查阅、收集相关文献资料，设计实验方案，撰写开题报告。

第3～8周： 做实验，记录数据，处理讨论数据结果，准备期中小结。

第9～13周：针对实验中出现的问题修改与完善,对前期做的实验进行优化，得到最优结果。