1. 研究目的与意义

视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)是青光眼等视神经退行性病变的主要损伤细胞，它的死亡常导致视功能不可逆性损害，最终引起视力严重下降甚至失明，是眼科常见也是难治性疾病，目前尚缺乏有效治疗措施。因此，寻找合适的药物预防、阻断或逆转RGCs凋亡是治疗该类疾病的根本环节，也是目前研究的热点之一。

N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的神经兴奋性毒性(过量的谷氨酸对神经元有兴奋性毒性作用，诱导神经元凋亡)在眼部视网膜变性疾病中有重要作用，NMDA受体拮抗剂在临床应用中未发现有效的视神经保护作用，可能原因与NMDA受体不同亚基（NMDA受体分为NRl,NR2和NR3亚基，其中的NR2又由NR2A,NR2B,NR2C和NR2D亚基组成）有关。本研究通过观察NR2A和NR2B亚基对于视网膜神经节细胞的不同作用，探讨NMDA受体拮抗剂保护视网膜神经节细胞的作用机制及可能的相关药物。

2. 课题关键问题和重难点

1.大鼠视网膜神经节细胞rgc-5细胞系培养；

2.确定能反映拮抗剂对细胞影响程度的指标；

3.寻求新的有关n2ra或n2rb受体拮抗剂；

3. 国内外研究现状（文献综述）

无论是何种类型的青光眼，其最终的病理损伤过程都是视网膜神经节细胞的进行性凋亡。目前对于引起视网膜神经节细胞进行性凋亡的发生机制仍不十分清楚，为此，国内外研究者以视网膜神经节细胞为靶细胞，进行了大量的动物实验和体外研究，如建立视网膜神经节细胞的体外培养体系，研究该细胞的生物学特性及其损伤机制，寻找抑制视网膜神经节细胞凋亡的途径及方法等，多数研究者采用大鼠进行视网膜神经节细胞培养^[1-2]。

视网膜神经节细胞属于高度分化的终末细胞，细胞分化后不再进行有丝分裂，因此体外培养较困难。目前国内外有关大鼠视网膜神经节细胞培养的文献资料较多^[3]，现已有成熟稳定的培养方法。

大鼠视网膜神经节细胞的培养有多种模型^[4]：(1)视网膜的种植培养；(2)视网膜神经细胞的混合培养或联合胶质细胞的混合培养；(3)转基因视网膜神经节细胞系(rgc-5)；(4)视网膜神经节细胞的纯化培养。上述培养方法各有其特点及应用价值，神经节细胞在各种培养模型中有其不同的存活形态和时间，不同的培养方式对细胞的生物特性影响较大，这些影响主要来自于其周围的细胞及培养环境。视网膜的种植培养保留了视网膜上所有细胞的多样性及排列特点，而且避免了分离各层细胞所带来的损失。视网膜细胞的混合培养中神经节细胞较易存活，可以观察到多种细胞的相互作用，但是细胞之间的排列关系已被打乱。视网膜神经节细胞rgc-5是应用鼠视网膜细胞通过转染技术建立的细胞系，其细胞膜或细胞内表达的物质与视网膜神经节细胞一致，但这些细胞具有有丝分裂的活性，转染的大鼠rgcs系rgc-5细胞系（能传代）可用于研究rgcs的生物和生理特性以及作为青光眼的体外实验模型^[5]。视网膜神经节细胞的纯化培养具有很多优势，其纯化率可以达到95％，在离体的观察研究中可以排除其他细胞和各种因素的干扰，便于获取更为确切、重复性好的观察指标，是多数细胞纯化培养中不可缺少的研究方法之一。

4. 研究方案

（1）大鼠视网膜神经节细胞RGC-5的传代培养；

购买RGC-5细胞系,高糖DMEM培养基 10%进口胎牛血清（GIBCO） 1%双抗常规培养RGC-5细胞。

（2）以大鼠视网膜神经节细胞株RGC-5损伤模型为研究对象，用NVP-AAM077（NR2A选择性拮抗剂）和R025-6981（NR2B选择性拮抗剂）处理，探讨NR2A和NR2B亚基在大鼠视网膜神经节细胞株RGC-5损伤中的作用及可能机制。

实验分组：正常细胞培养组（对照组），谷氨酸损伤组，单纯NVP-AAM007组，单纯Ro25-6981组，不同浓度NVP-AAM007保护组，不同浓度Ro25-6981保护组......　

5. 工作计划

第一学期:

第14-16周确定毕业论文题目，查阅相关文献资料，确定与课题有关的论文文献，并针对此课题与导师进行交流研讨。

第17-18周初步确定研究方案，撰写任务书和开题报告。