黄瓜绿斑驳病毒免疫电化学阻抗检测技术开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：黄瓜绿斑驳花叶病毒，学名 cucumber green mottle mosaic virus，是由ainsworth (1935)首次记述，是侵染葫芦科作物的重要病毒，可引起黄瓜、西瓜等叶片黄化畸形，生长缓慢，结果延时，果实大部分黄化变白并产生黑绿色水疤状的坏死斑，产量损失达15%，是世界上许多国家和地区葫芦科作物上的重要检疫性病毒[1]。

因此研究一种能在田间快速测验出此病毒的方法对此种病害的防治有深远的意义。

国内外现状：目前，检测cgmmv的方法主要采用生物学检测、电镜直接观察、rt-pcr和血清学检测等。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本课题的主要研究目标是研究黄瓜绿斑驳病毒（抗原）和相对应抗体在电化学免疫传感器中反应最适宜的条件。

研究内容：（1）免疫原的制备：根据黄瓜绿斑驳花叶病毒的特点，将其外壳基因与质粒进行载体构建，转化，进行原核表达，用于免疫balb/c小鼠；（2）包被原的制备：温室种植本氏烟，将发病的叶片于0.15m pbs缓冲液中研磨后摩擦接种未发病的叶片，7-14天左右观察收集，于-80度冰箱保存，用于elisa法检测单克隆抗体；（3）特异性抗体制备：将人工合成的免疫原免疫balb/c小鼠后，用杂交瘤细胞制备技术筛选得到特异性识别黄瓜绿斑驳花叶病毒的单抗隆抗体。

用腹水制备方法大量获得单克隆抗体，并用辛酸-硫酸铵饱和沉淀法纯化抗体；（4）电化学免疫传感器构建：将纯化得到的抗体稀释不同浓度修饰玻碳电极，通过电化学工作站，采用三电极体系，检测抗原目标物，进行检测条件的优化。

3. 研究的方法与方案

研究方法：（1）循环伏安法：循环伏安法是一种常见的电化学研究方法，随时间以三角波形一次或多次反复扫描,电势范围是使电极上能交替发生不同的还原和氧化反应,并记录电流一电势曲线。

根据曲线形状可以判断电极反应的可逆程度,中间体、相界吸附或新相形成的可能性,以及偶联化学反应的性质等。

常用来测量电极反应参数,判断其控制步骤和反应机理,并观察整个电势扫描范围内可发生哪些反应,及其性质如何。

4. 研究创新点

特色或创新之处：在此课题之前还没有任何相关黄瓜绿斑驳病毒电化学免疫检测技术的研究。

5. 研究计划与进展

研究计划：1、2017.12-2018.01协助实验室完成实验所用的免疫原、包被原，制备饲养细胞，免疫BALB/C小鼠，达到一定效价后取其脾脏制备免疫脾细胞，与SP2/0进行融合，克隆与亚克隆使用ELISA体系检测细胞培养上清液中测定出来的阳性细胞，获得能大量分泌抗体的杂交瘤细胞；2、2018.02利用循环伏安法、交流阻抗法完成对玻碳电极的标准曲线的建立；3、2018.03-2018.04制备电化学阻抗免疫检测传感器，建立标准曲线；4、2018.05数据整理分析，完成论文。

预期进展：（1）筛选可分泌亲和力高、特异性强的抗黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（2）建立高灵敏、快速方便的黄瓜绿斑驳病毒电化学免疫分析方法。