丁香假单胞大豆致病变种hrpZ基因的克隆表达及编码蛋白的纯化与功能研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

近些年来，全国大豆生产区的细菌性斑点病日趋严重，给农业生产带来巨大损失，其致病菌Pseudomonas syringae pv.glycinea是世界范围内重要的植物病原细菌。同其它革兰氏阴性植物病原细菌一样，这种致病菌中也拥有hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因。hrp基因赋予病原细菌在非寄主植物及抗病植物上引发过敏反应（hypersensitive response, HR）和在感病寄主植物上的致病（pathogenicity）能力。由于hrp基因成簇地存在于植物病原细菌的基因组上，所以被称为hrp基因簇。20世纪80年代初Lindgren等人通过Tn5诱变丁香假单胞菌菜豆萎蔫致病变种（Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola）首次发现了hrp基因簇。此后这类基因就一直得到相关领域学者的高度重视，并进行了广泛而深入的研究。基于hrp致病岛的III泌出系统TTSS在多种病原细菌中高度保守，通过该系统，可将许多效应蛋白注入到植物细胞中。

Harpin蛋白是植物病原细菌III型蛋白泌出系统泌出的非特异性激发子，是目前研究得较为广泛深入的一类细菌分泌蛋白。1992年韦忠民等首次从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中分离出一个激发过敏反应的蛋白，定义为HarpinEa，大小为44KD，由hrpN基因编码，通过III型泌出系统泌输到胞外，富含甘氨酸（Gly），不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白酶K敏感，HarpinEa可以引起非寄主植物上的过敏反应。1993年何胜阳等又从Pseudomonas syringae pv.syringae 61菌株中分离到HarpinPss，由hrpZ基因编码，与HarpinEa相似，它也富含甘氨酸（Gly），不含半胱氨酸（Cys），热稳定，对蛋白酶K敏感。然而hrpZ和hrpN缺乏同源性，它们只有22个氨基酸存在同源性，且此片段与功能无关。这也基本符合同一植物病原细菌不同致病变种之间编码harpin的hrp基因的同源性较高，不同属的病原细菌之间编码harpin的hrp基因的同源性较低。

Harpin_Xo是另一类研究得较为深入的harpin蛋白，包括Harpin_Xoo和Harpin_Xooc。来自于水稻黄单胞白叶枯致病变种，由hrf1基因编码的被称为Harpin_Xoo；来自于水稻黄单胞细条斑致病变种，由hrf2基因编码的则被称为Harpin_Xooc。关于这方面的内容我们实验室也做了较为深入的研究。微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物，按照作用机理的不同又可以分为传统的微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质。有代表性的即为harpin蛋白，与传统的微生物农药BT相比最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫相关基因的表达，并促进植物的生长发育。以往研究表明harpin蛋白可以通过启动多种信号途径来诱导植物获得抗性。Harpin_Xoo和Harpin_Xooc可以诱导离体叶片和活体棉花对蚜虫的抗性，促进番茄和烟草的生长。温室和田间实验都证明harpin处理作物可促进植物生长发育，提高产量。在促进植物生长发育的同时还能增加植物根干物质，有利于植物忍受逆境，也有利于忍受土传病害(线虫等)病原物的为害。同时经harpin处理后可增加多种作物的净光合作用，较少作物产后损失，但也有相关实验表明过高浓度的harpin蛋白也会抑制植物生长。

本课题组最近从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea）A1和S1菌株中分别克隆到hrpZ_psgA1和 hrpZ_psgS1基因。这两个基因在核酸水平的同源性只有79%，氨基酸序列的同源性只有77%。而在诱导HR能力的差异显著。分析表明，hrpZpsgS1与hrpZpsgA1的差异集中在3个区域，推测这三个区域可能与HR功能域相关。计划采用重叠PCR的方法将hrpZpsgS1和hrpZpsgA1的这三个区域分别进行互换，以确定其HR功能区域。

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