筛选对番茄具有促生及抗青枯病作用的AM真菌开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

菌根是指土壤中某些真菌与植物根系的共生体，分布广泛，历史悠久。早在4亿多年前，菌根真菌就与古老的陆生植物形成了菌根。菌根真菌与植物之间建立相互有利、互为条件的生理整体，并各有形态。

am真菌对植物生长的效果已有较多报道，am真菌增加植物根系吸收面积，促进植物对矿物质元素，尤其是磷元素的吸收，提高植物抗旱能力，降低植物土传病害的发生，改变植物内源激素平衡状况，促进豆科植物结瘤等等，具有广泛的应用前景。中国粮食作物中am真菌的种类丰富，am真菌可与水稻、小麦、大麦、大豆、玉米、甘薯、花生、高粱、荞麦、谷类、燕麦和绿豆等作物形成共生关系，已报道的有5属24个种；接种am真菌可明显提高作物产量，促进作物对矿质元素的吸收，刘文科等（2006）在对玉米接种am真菌的研究中得到相似结果，同时发现根系对磷的吸收率高于地上部。am真菌亦可增强作物抗胁迫能力，胡志宏等（2010）研究发现，接种am真菌摩西球囊霉（g. mosseae）后，油菜、玉米和小麦幼苗的生物量、株高、根长显著提高，同时，植株吸收了更多的钾、磷等元素，farzaneh等（2011）在对鹰嘴豆（chickpea）的研究中也得到了类似结果。am真菌促进作物矿质养分吸收利用、提高作物产量和提高抗逆性的作用日益受到关注，其在农、林业的应用途径与方法正成为各个国家研究的重点，一些am真菌接种剂商业化产品已经上市，在不久的将来，接种菌根技术必将具有广阔的应用前景。

细菌性青枯病是由茄青枯劳尔氏菌引起的一种维管束病害，它是一种毁灭性的土传病害，在世界范围内均有分布，寄主植物范围超过50科200种，包括花生、番茄、烟草和香蕉等经济作物, 以及木麻黄和桉树等造林树种（(hayward 1995）。由于缺少有效的控制途径，青枯病每年都会给农业及园艺作物造成严重的损失，其防治受到了国内外研究者的高度重视，目前尚未发现有效的防治方法。

2. 研究的基本内容和问题

研究内容

在前期研究的基础上，利用实验室自主鉴定扩繁的数种am真菌对温室番茄促生及抗病情况进行研究，并探究不同am真菌对番茄根系侵染情况；

工作假说

3. 研究的方法与方案

实验对象

番茄品种为合作903

实验菌剂

AM真菌种类为：

毛氏无梗囊霉Acaulosporamorrowiae；

刺状无梗囊霉Acaulosporaspinosa；

极大巨孢囊霉Gigasporagigantean；

珠状巨孢囊霉Gigaspora margarita；

近明球囊霉Glomus claroideum；

明球囊霉Glomus clarum；

幼套球囊霉 Claroideoglomus etunicatum；

摩西球囊霉Funneliformis mosseae（同Glomusmosseae）；

根内球囊霉Rhizophagus intraradices（同Glomusintraradices）

实验方法

菌根苗的培育

将参试植物种子用 10% H₂O₂表面消毒 10min，无菌水洗净后晾干备用。接种时菌剂包括侵染植株根段以及孢子，每个盆钵中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g菌剂，以保证正常接种。每个营养钵播种 10 粒种子，正常浇水管理4周后，将菌根苗移栽至330ml塑料杯中，移栽时选择长势一致的植株开展实验。本实验共设置两个处理：菌根苗处理组以及空白处理组，每组处理24株苗。

生物量测定

接种移栽后每天观察，记录株高、茎粗、叶色、最初开花时间、开花数量。计算每处理平均值，将可获得内容的平均值填入下表。

表1 样品生物量测定

在植株开花之前，进行叶绿素的测定：将叶片去脉剪碎，随机取样，准确称重取0.5 g放入25 mL容量瓶中。用提取液（体积比为2:1的丙酮-无水乙醇混合液配成95%的水溶液）定容，放于25 ℃的恒温培养箱内暗中提取24 h，至组织变白。在663 nm、645 nm波长下以提取溶剂作空白对照，测定样品液在663 nm和645 nm下的吸光度值。

叶绿素浓度按下列公式计算（单位为mg/L）：

C_a=12.7A₆₆₃－2.59 A₆₄₅

C_b=22.9A₆₄₅－4.67 A₆₆₃

C_T=C_a C_b

式中：A₆₆₃入射光为663nm时的吸光值；

A₆₄₅入射光为645nm时的吸光值；

叶绿素含量按下式计算：

碱解离-酸性品红法测定根系侵染率

移苗六周后，用酸性品红法对菌根真菌侵染率进行测定。将根样洗净后，剪成长约1 cm根段。10% KOH透明，90℃处理20-60 min，用自来水轻轻冲洗根系3次，加入2% 的HCl溶液浸泡5 min。去掉酸液后加入0.01%的酸性品红乳酸甘油染色液（乳酸875 ml，甘油63 ml，蒸馏水63 ml，酸性品红0.1 g），90℃水浴20-60 min, 或于室温下过夜。加入乳酸分色后镜检，植物细胞不着色，真菌组织可被染成红色。

菌根侵染率（%）=∑[（0% 根断数 10% 根断数 100% 根断数）]/ 观察总根段数

丛枝菌根真菌防治番茄青枯病温室防效测定

将培育的番茄菌根苗及非菌根化苗移栽至新的营养钵中，新营养钵中所用土壤为灭菌土，移栽3d后接种青枯病原菌ZJ3721。平板活化青枯菌ZJ3721，500 ml YGPA培养液中过夜摇菌（200rpm/min,20-24 h,30 ℃），在试验前通过预实验明确试验中青枯菌ZJ3721的CFU与OD值之间的对应关系，在测定过程中，对于浓度大的菌悬液需用未接种的液体培养基适当稀释后测定，使其OD₆₀₀值控制在0.3～0.6，经过稀释后测得的OD₆₀₀值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD₆₀₀值。在正式开展实验时，在无菌条件下取出培养好的菌液，将菌液用未接种的培养液稀释一定倍数后，以未接菌的培养液作为对照调零，用分光光度仪测定其OD₆₀₀值，根据之前预实验测算出的OD₆₀₀值与其浓度的关系，确定菌液的浓度。同样对于浓度大的菌液需用未接种的液体培养基适当稀释后测定，使其OD₆₀₀值控制在0.3～0.6，经过稀释后测得的OD₆₀₀值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD₆₀₀值。随后使用0.85%Nacl溶液将菌液浓度调至110⁷CFU/mL进行灌根处理，每株番茄苗浇取20ml的青枯菌液。之后每天调查发病情况，按青枯病分级指标，进行病情指数统计，对温室实验结果进行调查。

4. 研究创新点

首次使用AM真菌防治番茄青枯病。

5. 研究计划与进展

进度安排

预期结果与可能存在的问题

1、预期结果

筛选到能与番茄根系建立共生关系并能促生防病的AM真菌；