1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 试验意义
维吉尼亚霉素预混剂（速大肥）主要成分为维吉尼亚霉素，作为适用于家禽和猪的药物饲料添加剂，主要用于动物促生长及改善饲料报酬。本课题通过考察速大肥对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果，同时建立肉鸡人工感染产气荚膜梭菌模型，制定速大肥用于预防肉鸡坏死性肠炎的给药方案，并以此方案评价速大肥对肉鸡坏死性肠炎的预防效果，可为兽医临床预防肉鸡坏死性肠炎提供了新的用药方案，对减少肉鸡坏死性肠炎给肉鸡养殖业带来的经济损失有重要意义。
2 国内外研究概况
肉鸡坏死性肠炎（necrotic enteritis,ne）又叫肠毒血病，主要是产气荚膜梭菌（clostridium perfringens, cp）导致的一种消化道传染病，其多发于2~8周龄的肉鸡，在集约化养殖场中一旦发病，将会快速传播 [1]，具有比较高的发病率和死亡率。据估计，在2015年，由于在肉鸡坏死性肠炎发生的早期阶段不容易诊断和控制，其造成的全球经济损失已从20亿美元增加到了60亿美元[2]。严重危害了各地禽类养殖业的发展，造成了重大的经济损失。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
测定维吉尼亚霉素对产气荚膜梭菌的mic，并通过建立肉鸡坏死性肠炎疾病模型，研究其对产气荚膜梭菌引起的肉鸡坏死性肠炎的预防效果。
2 试验内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
（1）测定维吉尼亚霉素对产气荚膜梭菌的MIC，进行速大肥对产气荚膜梭菌的体外抑菌试验；
（2）通过建立肉鸡坏死性肠炎疾病模型，研究其对产气荚膜梭菌引起的肉鸡坏死性肠炎的预防效果；
2 试验方案
2.1 体外抑菌试验
2.1.1 菌液制备
在超净台内用已用火焰灼烧过的接种环取产气荚膜梭菌菌种粉末于配制好的灭菌疱肉培养基中，将接种后的试管37 ℃厌氧培养12h，传代培养1代后通过菌落计数确定菌悬液浓度。
菌落计数步骤：将已培养12h 的菌液以1:10 稀释液按1mL加入灭菌生理盐水9 mL制备10-2～10-9的系列稀释液。然后吸取10-5～10-9稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做3个平行。每个平皿倾注冷却至50 ℃左右的TSC琼脂（可放置于50 ℃恒温水浴锅中保温）12-15 mL，缓慢转动平皿，使稀释液和琼脂培养基充分混匀。待琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50 ℃的TSC琼脂均匀覆盖平板表层。最后凝固后，正置于厌氧培养装置内，37 ℃培养20h～24 h。典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
2.1.2 MIC测定
采用试管稀释法测定维吉尼亚霉素对产气荚膜梭菌标准菌株的MIC值。步骤如下：（1）用甲醇溶解并稀释维吉尼亚霉素原料药，配制浓度为1280 μg/ml的母液；（2）取9个10 ml已灭菌的EP管，依次做好顺序标记后每管加入4 ml甲醇；（3）从已配好的母液中吸取4 ml加入已编号的第1管中，涡旋混匀后依次用甲醇进行倍比稀释，分别配制640、320、160、…、5、2.5 μg/ml的药液，分别用0.22 μm滤头过滤后，备用；（4）取11支疱肉培养基，分别编号为1、2、3...11，1-9号每管加入5.4 ml培养基，同时依次加入稀释好的药液0.6 ml和菌液0.1 ml，则每管中药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。10号管为菌液对照管，不加药。11号管为培养基对照管；（5）37℃厌氧培养12h，观察菌生长情况，即培养基浑浊程度；（6）重复测定3次，求MIC平均值。
2.2 试验分组及处理
将1日龄肉鸡饲养至12日龄时，随机取360只分为6组，每组60只，并分为两个重复，每个重复30只，具体分组见表1。
表1 试验分组及处理
| 分组 | 数量（只） | 处理 |
| 速大肥高剂量组 | 30 | 7日龄开始饲喂含维吉尼亚霉素40 mg/kg饲料 |
| 30 | ||
| 速大肥中剂量组 | 30 | 7日龄开始饲喂含维吉尼亚霉素20 mg/kg饲料 |
| 30 | ||
| 速大肥低剂量组 | 30 | 7日龄开始饲喂含维吉尼亚霉素10 mg/kg饲料 |
| 30 | ||
| 阿维拉霉素预混剂 | 30 | 7日龄开始饲喂含阿维拉霉10 mg/kg饲料 |
| 30 | ||
| 阳性对照组 | 30 | 不添加药物 |
| 30 | ||
| 阴性对照组 | 30 | 不攻毒不添加药物 |
| 30 |
2.3 毒力基因检测
2.3.1 制备DNA模板
将菌株在疱肉培养液中培养过夜，取2mL 菌液13 000r/min 离心5min ，倾去上清液，加入500 μL 双蒸水使其悬浮，13000 r/min 离心5 min ，双蒸水重复洗涤菌体2次，最后将菌体混悬于100μL 双蒸水中，反复冻融3 次，13000 r/ min 离心2 min，取上清液作模板DNA 。
2.3.2 毒力相关基因的检测
参照Yoo 文献报道的产气荚膜梭菌α、β 、ε、ι毒素基因cpa 、cpb 、et x 及iA 序列，设计出针对4 种毒素基因的4 对特异引物（引物序列见表2）， 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表2 多重PCR引物序列
| 毒素 | 基因 | 引物序列 | 片段大小 |
| α | CPA | Forward 5’-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3’ Reverse 5’-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3’ | 402 |
| β | CPB | Forward 5’-ACTATACAGACAGATCATTCAACC-3’ Reverse 5’-TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGAC-3’ | 236 |
| ε | CPE | Forward 5’-ACTGCAACTACTACTCATACTGTG-3’ Reverse 5’-CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCC-3’ | 541 |
| ι | CPI | Forward 5’-GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC-3’ Reverse 5’-GGTATATCCTCCACGCATATAGTC-3’ | 317 |
多重PCR扩增：参照Yoo等的方法进行多重PCR，反应体系为25μL，
包括：2×PCRMix 12.5μL；
引物(50pmol)各0.1μL；
模板DNA2.0 μL；
双蒸水补足至25μL 。
反应程序：94℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72 ℃ 1 min（30个循环）；72℃10 min 。PCR 反应结束后，取8μL PCR 产物在2%琼脂糖凝胶80V电泳40 min，在BIORAD凝胶成像系统下观察扩增片段的大小。
2.4 人工感染模型的建立
在肉鸡接种产气荚膜梭菌前，先将菌种接种于疱肉培养基，在37℃厌氧培养12 h，以细菌计数法测定培养物的含菌数为5×108 CFU /mL。
最小感染量（MID）的测定：将健康雏鸡分成4组，每组20只，10日龄时经口灌喂1ml鸡球虫病四价活疫苗（鸡球虫病四价活疫苗按说明书加1000 ml水稀释，相当于浓缩6倍）。从12~14日龄（共3天），每天上午饲喂前经口灌喂试验菌液15×108 CFU /只，25×108 CFU /只，50×108 CFU /只（均浓缩至1mL/只灌喂），攻毒后3小时禁食禁水，观察5天，记录发病数和死亡情况，以5天内致全部发病的最小剂量为最小感染量。
正式试验时，以最小感染量在10~14日龄时参照已建立的方法进行攻毒，攻毒完毕后继续饲喂含药饲料10天。
2.5 考察指标
在试验接种前（12日龄)和试验结束当天（24日龄)分别称各组鸡的重量，并记录饲料消耗量，计算各组平均日增重和饲料转化率。
详细观察和记录试验开始后、给药前及给药后每天各组鸡的临床变化和死亡情况，对死亡的鸡进行剖检观察病变情况，并取肠黏膜进行产气荚膜梭菌培养。试验结束时，每组每个重复各处死10只鸡，仔细观察小肠和盲肠病变，根据坏死性肠炎的严重程度计分，计分标准为0，1，2，3四级（见表3）。
表3 病变记分标准
| 病变记分 | 病变程度 |
| 0 | 肠道正常，无肉眼病变 |
| 1 | 肠壁变薄或纤维素样 |
| 2 | 局部坏死或溃疡 |
| 3 | 大面积坏死 |
2.6 病原分离
人工感染后，采集肛门棉拭子，作接种菌的分离培养，PCR检查接种菌的情况。试验过程中每3天（即15，18，21，24日龄）同样进行肛门棉拭子接种菌的PCR检查，试验结束时每个重复采集当天新鲜粪便2份，将每份粪便混匀后检查粪便中产气荚膜梭菌的数量。
3 可行性分析
维吉尼亚霉素对动物肠道内多种致病菌具有较好的抗菌活性，且已有研究表明其在预防产气荚膜梭菌诱发的坏死性肠炎上有效，可为本项目的实施提供理论基础。此外，兽医药理学与毒理学教研室具有丰富的药效评价经验，可保障本项目的顺利实施。
4. 研究创新点
通过大量动物试验，成功建立产气荚膜梭菌引发肉鸡坏死性肠炎的人工感染模型，并得到速大肥对肉鸡人工感染产气荚膜梭菌的应用推荐剂量和用药程序。
5. 研究计划与进展
1 试验研究计划
2018年9月 文献检索，试验前期准备
2018年10月~ 11月 进行菌液培养及预试验并确定给药方案
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