利用BiFC技术验证小麦基因TaSKP1与RA的互作开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

蛋白互作是一项基本的细胞事件，它发生在所有亚细胞结构及细胞器中的每一个生理过程中。阐明蛋白质的相互作用在何时、何地发生以及蛋白质复合物如何形成能为确定蛋白质生物学作用提供决定性线索。因此，确定和阐明活细胞中特殊蛋白之间的互作对于理解和研究细胞生物学的各个方面是必不可少的。

近年来，对蛋白质相互作用的研究十分活跃，研究手段也非常丰富,既有体外实验如免疫共沉淀[1]、表面等离子共振[2]、蛋白质芯片等[3],也有体内实验如酵母双杂交[4]、荧光共振能量转移[5]、蛋白质片段互补等[6]。而双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation，bifc)分析技术，为我们在荧光显微镜下直接观察蛋白质的相互作用提供了一种直接的途径[7]。

双分子荧光互补技术是由hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[8]。bifc技术基于完整荧光蛋白的重建，荧光蛋白家族的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响其荧光活性，该技术利用这一特性，将荧光蛋白在适当的位置进行合理的切割，形成的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，若目标蛋白互作，则两个片段空间上靠近重新形成具有活性的荧光蛋白而发出荧光。

2. 研究的基本内容和问题

该课题利用BiFC技术检测小麦基因SKP和CFBD之间的互作，摸索、比较拟南芥原生质体转化法和基因枪介导的转化法之间的转化效率，选择最优的转化条件和方法，初步创建小麦BiFC技术体系。

3. 研究的方法与方案

该课题利用双分子荧光互补分析技术来初步构建小麦bifc体系，探索较优的条件与方法，以用来分析与小麦中功能基因发生相互作用基因。

技术路线：设计候选互补基因的特异引物、扩增基因序列、构建双分子荧光互补表达载体、序列验证、摸索和比较peg介导的拟南芥原生质体转化与基因枪转化的效率、瞬时转化互补基因、采用激光共聚焦显微镜观察阳性互补基因的互作结果。

实验方案：利用小麦中skp与cfbd两个互作基因作为转化对象，克隆这两个基因，构建双分子荧光互补表达载体，之后通过多次实验分析，比较本实验室条件下peg介导的拟南芥原生质体转化与基因枪转化之间的转化效率，选择最优的转化条件和方法，以用于小麦中基因互作的研究。

4. 研究创新点

创建适于小麦研究的最优BiFC技术体系，提高试验效率，以便探索小麦中特殊蛋白之间的相互作用，从而用于小麦抗病、耐胁迫等机制的研究中。

5. 研究计划与进展

2013.7－2013.8：学习实验基本技术，理解bifc技术原理；

2013.8－2013.9：学习制备拟南芥原生质体

2013.9－2013.10：学习peg介导的拟南芥原生质体转化及基因枪转化