水稻OsRSG1基因的遗传转化及其功能初探开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、研究意义赤霉素(gibberellin,gas)是广泛存在于植物界的一种四环双萜类植物激素，调控植物生长的多个方面，如种子萌发、茎的伸长、花器官的发育等[1-3]；并且植物也通过调节内源性赤霉素生物合成而介导其自身对环境因子的应答。

因此，调控赤霉素的生物合成对植物的生长发育及其对环境的适应有着极为重要的作用[4]。

2、国内外研究现状fukazawa等在烟草中分离鉴定了一个含有碱性亮氨酸拉链(bzip)结构域的ga合成调控转录因子rsg，通过调节ga合成关键酶ko（贝壳杉烯(ent-kauene)氧化酶）和ga20ox1（ga18氧化酶）的表达来控制内源ga含量[5]，从而对植物体内ga水平进行调节。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标在本实验的研究基础上，克隆出水稻中的rsg基因(nm_001072756)，构建亚细胞定位的表达载体，完成农杆菌介导的水稻转化，明确rsg应答不同逆境条件下的细胞定位及其表达水平与ga含量的关系，为进一步探讨rsg作用的分子机制，分析其参与调控ga生物合成的作用机理提供理论支持。

2、研究内容(1)克隆获得水稻中的rsg基因；(2)构建rsg与绿色荧光蛋白(green florescent protein,gfp) 的融合表达载体，进行细胞定位；(3)诱导培养水稻未成熟胚的愈伤组织，完成rsg/gfp农杆菌介导的水稻转化，获得转化体；(4)诱导培养水稻悬浮细胞，经ga及各种胁迫处理后，分离悬浮细胞的原生质体(protoplast)，进行gfp的荧光定位分析；(5)对比野生型台南67，探究osrsg1基因的水稻转化细胞rsg的表达量变化，验证其是否过量表达；(6)通过检测发芽水稻种子在不同芽长阶段的rsg表达水平，分析rsg与ga含量的关系，探究不同rsg含量对水稻株高变化的影响。

3、拟解决的关键问题明确rsg在不同逆境及生长条件下的表达特性和细胞定位，初步探究其参与植物激素信号转导、抗逆性以及在ga生物合成途径中的功能。

3. 研究的方法与方案

1、拟采取的研究方法(1)利用比较基因组学、公共生物信息数据库等方法，根据osrsg1密码序列，设计forward primer及reverse primer，利用pcr方法克隆出水稻rsg基因的cdna全长；(2)重组dna技术：利用限制性核酸内切酶将osrsg1构建入含有绿色荧光蛋白gfp的植物表达载体(ubi::osrsg1/gfp)，完成质粒重组；(3)农杆菌介导转化技术：诱导获得水稻愈伤组织，并将愈伤组织继代培养得到胚性愈伤组织，然后将ubi::osrsg1-gfp表现载体转化(transformation)到农杆菌eha101中，再利用转型成功的农杆菌株感染水稻愈伤组织完成转化，获得转化成功的水稻愈伤组织后，再诱导获得转化植株；(4)荧光蛋白标记技术：将胁迫处理后的悬浮细胞于荧光体视镜下观察拍照，对标记gfp的osrsg1基因进行亚细胞定位；(5)rt-pcr技术：探究osrsg1基因的水稻转化细胞rsg的表达量变化；分析发芽水稻种子在不同芽长阶段的rsg表达水平与ga含量的关系。

2、技术路线克隆获得水稻中的osrsg1基因，构建rsg与绿色荧光蛋白gfp的融合表达载体，诱导培养水稻未成熟胚的愈伤组织，农杆菌介导转化法完成rsg/gfp表达载体在水稻愈伤组织中的转化，诱导培养水稻悬浮细胞，以ga、aba、nacl及cacl2等处理后，分离悬浮细胞的原生质体，并进行gfp的荧光定位分析；利用rt-pcr技术，探究osrsg1基因的水稻转化细胞rsg的表达量变化，明确rsg表达水平与ga含量的关系；获得转化体，炼苗并移栽，进行osrsg1过量表现植株的生理型态分析。

3、实验方案本研究主要通过绿色荧光蛋白gfp标记目标基因osrsg1，再运用农杆菌介导转化技术转化水稻愈伤组织，诱导培养水稻悬浮细胞并进行ga或胁迫处理，最后完成亚细胞定位，并明确其表达水平与ga含量的关系，旨在分析验证rsg的初步功能，同时获得转化植株，进行osrsg1过量表现植株的生理型态分析。

4. 研究创新点

转录启动因子RSG在调控植物体内GA生物合成中起着关键作用，并且可能在激素信号转导中与植物中的钙传感器CDPK存在相互作用，参与植物抵抗多种逆境胁迫的应答过程，该基因的研究和应用对于加强人们对激素信号转导的认识有着重要价值。

目前关于水稻RSG基因的机制研究目前尚未报导，阐明该基因的作用分子机制将极具探索性，并且有助于深入理解赤霉素生物合成途径过程，指导育种和生产实践。

5. 研究计划与进展

2014年7月至8月：利用比较基因组学、公共生物信息数据库等方法克隆水稻中的RSG基因cDNA全长；2014年9月至10月：构建亚细胞定位所需表达载体，诱导培养水稻愈伤组织；2014年11月至12月：进行农杆菌介导的水稻转化，培养悬浮细胞并获得相关转化体；检测发芽水稻种子在不同芽长阶段的RSG表达水平，明确RSG表达水平与GA含量的关系；2015年1月至2月：完成RSG基因在不同处理条件下瞬时表达的细胞定位，验证转化细胞RSG是否过量表达，并分析其参与激素信号转导和在GA生物合成过程中的初步功能；2015年3月至4月：对实验所得数据进行整理、分析和补充，撰写论文。