pENTR/D-TOPO载体改造及其应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本项目的研究意义：

为探寻一种快速的、便捷的以及低成本的，且与gateway系统功能兼容的载体，即通过在克隆载体pentr/d-topo上插入puc19的多酶切位点，从而对pentr/d-topo载体进行改造；利用gateway系统通过lr反应，将水稻ago18、prmt基因分别连接到目的载体peg202、peg201上，转入农杆菌后注射烟草，并通过western bolt验证osago18和osprmt是否存在互作关系。pentr-mcs质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，也为验证其功能和蛋白互作方面的研究奠定了基础。

2. 研究的基本内容和问题

项目研究目标：

①通过pcr技术克隆出puc19-mcs，将克隆出的puc19-mcs连接到目的载体pentr/d-topo上，从而对pentr/d-topo进行改造；②利用gateway系统通过lr反应，将水稻ago18、prmt基因分别连接到目的载体peg202、peg201上，转入农杆菌后注射烟草，并通过western bolt验证osago18和osprmt是否存在互作关系。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本试验通过在克隆载体pentr/d-topo上插入puc19的多酶切位点，从而对pentr/d-topo载体进行改造；利用gateway系统通过lr反应，将水稻ago18、prmt基因分别连接到目的载体peg202、peg201上，转入农杆菌后注射烟草，并通过western bolt验证osago18和prmt是否存在互作关系。pentr-mcs质粒的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，也为验证其功能和蛋白互作方面的研究奠定了基础。我们将这一方法称为衔接子引物-pcr引入法。

技术路线：

4. 研究创新点

本试验通过克隆pUC19-MCS，将pUC19-MCS连接到目的载体pENTER，构建pENTR/D-TOPO载体，并研究PRMT和AGO18基因诱导产生的蛋白间是否存在互作。pENTR/D-TOPO载体的构建及应用为基因重组提供了一个快速有效的手段，也为基因功能研究奠定了基础。

5. 研究计划与进展

（1）、2014年9月20日-2014年10月5日，克隆puc19-mcs，并将puc19-mcs连接到目的载体pentr。

（2）、2014年10月6日-2014年10月10 日，转入jm109感受态细胞中，涂kana板，并挑取阳性单菌落送测序，测序正确后进行应用。

（3）、2014年10 月11日-2014年10月21日，将水稻ago18、prmt基因连接到pentr-mcs。