球头三型孢菌代谢木糖制备苏糖醇代谢途径构建开题报告

1. 研究目的与意义

球头三型孢菌研究背景：

球头三型孢菌（trichosporonoides oedocephalis）可耐受20%-60%（w/v）的葡萄糖，可以产生多种多元醇，比如赤藓糖醇、甘油、核糖醇等。球头三型孢菌可以通过ppp途径将葡萄糖转化为赤藓糖。本次实验将外源基因导入球头三型孢菌从而构建球头三型孢菌工程菌，通过菌体自身代谢将木糖转化为赤藓糖醇，然后通过表达导入的基因将赤藓糖醇转化为苏糖醇。通过菌体自身代谢木糖产生赤藓糖醇的菌主要从土壤、新鲜花粉、蜂蜜及蜂巢中分离出来。利用高浓度的葡萄糖培养基（葡萄糖浓度40%-50%),选择存活菌种接种于中浓度葡萄糖培养（20%-30% )中进行发酵，再利用薄层层析和高效液相色谱等方法分析筛选出赤藓糖醇产生菌，并测定其产量，筛选出高产菌种。国外对于赤藓糖醇菌株的选育方面研究较早：1956年加拿大科学家spencer等人在研究高渗酵母产生甘油时，发现由于菌种的生长速度及培养条件的不同，可产生赤藓糖醇；1964年hajny等人从新鲜花粉中分离出一株圆酵母（torula sp.)，转化率达到35%-40%；1989年ishizuka等人筛选出aureoasidi-um sp.sn-115菌株；1993年marina等人从蜂巢中分离出 trichosporonoides sp.150-5和331-1，它们可利用葡萄糖或蔗糖作为碳源发酵产生赤藓糖醇，转化率分别为30%和43%；1996年kim等人从蜂巢中分离出一株candida magnoliae，转化率为20%；1998年jin等人从蜂巢中分离出一株trichosporon sp.，该菌的转化率达到47%；1999年hirata等人从新鲜花粉中分离出一株ustilaginomycetes sp.618a-01，该菌在发酵过程中不会产生副产物甘油及阿拉伯糖醇等其他多元醇，且发酵起泡现象不明显；2001年lin等人从花粉和蜂蜜等中分离出6 株高渗酵母（moniliella sp.),转化率为37%；2009年jeya等人从污泥中分离出一株p.tsukubaensis kn75，利用葡萄糖作为碳源，经补料分批发酵，其转化率达到61%,是迄今报道赤藓糖醇产生菌中产量的最大者。国内起步较晚，吴艳等人(2001)、陶军玮等人(2003)、杨晓玮等人(2005)及叶娴等人(2007)先后从不同来源中分离得到赤藓糖醇的产生菌，但产率均偏低。经过众多研究总结发现，赤藓糖醇的生产菌株可分为酵母菌、霉菌和细菌，其工业生产中以耐高渗酵母发酵为主。目前国内外研究人员，主要在筛选出高产菌株的基础上，对其发酵培养基、发酵条件和发酵方式等条件进行优化，进一步达到高产的目的。

木糖研究背景：

2. 研究内容和预期目标

研究内容

本研究立足于国内外研究现状，构建能代谢木糖的球头三型孢菌工程菌，使之能生产苏糖醇。具体研究内容如下：

1）scheffersomyces stipitics cbs 6054木糖醇脱氢酶xdh的合成。

3. 研究的方法与步骤

氨苄西林是一种广谱抗生素，可以杀死多种革兰氏阴性菌或是阳性菌。我们所运用的质粒pyes2中含有β-内酰胺酶（β-lactamase），其可以将氨苄结构中的四元内酰胺环（β-内酰胺（β-lactam））水解，使其失去药性。由此，转化成功的细菌会携带这种基因，从而表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来，而那些转化失败的细菌将无法生长。

步骤

1.目的基因xdh的合成

4. 参考文献

5. 计划与进度安排

1）2024-03-01～2024-03-11：查阅资料撰写开题报告。

2）2024-03-11～2024-03-18：进行scheffersomyces stipitics cbs 6054木糖醇脱氢酶xdh的合成。

3）2024-03-19～2024-04-01： 含重组载体pet28a大肠杆菌bl21的构建、蛋白表达和酶反应实验。