氯噻啉噬菌体展示酶免疫分析方法的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

氯噻啉是南通江山农药化工股份有限公司自主研发的新型烟碱类杀虫剂，广泛用于防治吮吸式口器害虫，如叶蝉、飞虱、蚜虫及其抗性品系，同时对鞘翅目、鳞翅目和双翅目害虫也有防效。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉已被广泛使用。因此，研制氯噻啉快速、经济、灵敏度高、稳定性好和高通量的检测方法对保障农产品安全和环境安全具有重要的意义。另外，氯噻啉是一种广谱的新烟碱杀虫剂，对蜜蜂和其他授粉昆虫具有高毒性^[22,23]并污染生态系统^[24]。目前，氯噻啉残留常用检测方法是高效液相色谱法（hplc），但该方法样品前处理过程较繁琐，检测结果易受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品的快速检测。

免疫分析方法因其简便、快速、低成本和可多样品同时检测等特点，在农药残留快速筛查领域被广泛研究。但由于农药等小分子化学品为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。经研究表明，异源免疫分析的敏感性要远远优于同源免疫分析。而运用从噬菌体展示肽库中淘选竞争物的方法来代替传统化学合成获得竞争物的试错法，可以更快、更便捷的建立异源免疫分析方法^[5]。噬菌体展示技术是一种特殊的基因工程重组表达技术，已经作为一种强大的工具运用在不同的研究中，包括筛选抗体和酶的配体^[6、7]、筛选小分子的受体^[8、9]、基因工程抗体^[10、11]等。目前在农药等小分子免疫分析中的应用主要表现在模拟表位筛选，抗免疫复合体筛选及基于噬菌体展示多肽的特点建立的新免疫分析方法。cardozo等^[12]，kim等^[13]，hua等^[14]在农药及农药代谢物上做过相应尝试，建立的噬菌体elisa的敏感性比传统方法均有不同程度的提高。因此，噬菌体展示肽库技术凭借自身的独有优势和特点，在农药等小分子免疫分析中的发展前景是不可限量的。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

利用实验室现有的氯噻啉单克隆抗体和噬菌体展示随机多肽库，建立氯噻啉的噬菌体酶连免疫吸附分析（p-elisa）和噬菌体化学发光酶免疫分析（p-cleia）。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案：

1. 氯噻啉噬菌体多肽竞争物的制备及分析

以氯噻啉单克隆抗体为固相抗体对噬菌体展示随机多肽库进行亲和淘选，按照吸附－洗脱－扩增的循环进行，一般经过3~5轮的淘选获得噬菌体多肽竞争物。对获得的噬菌体多肽竞争物进行扩增、提取质粒、测序获得噬菌体多肽竞争物的序列信息。

4. 研究创新点

本课题以氯噻啉为研究对象，采用噬菌体展示技术和免疫分析技术建立噬菌体酶免疫吸附分析（P-ELISA）和噬菌体化学发光酶免疫分析（P-CLEIA），通过运用化学发光的方法改善了P-ELISA线性范围窄的问题。为氯噻啉残留检测提供了新颖、灵敏的免疫分析方法，并有助于噬菌体展示多肽技术在农药等小分子化合物免疫分析中的应用。

5. 研究计划与进展

2016.8~2016.12 利用氯噻啉单克隆抗体，从噬菌体随机多肽库环形七肽库、环形八肽库及线性十二肽库中，通过生物亲和淘选获得抗氯噻啉噬菌体多肽竞争物；

2016.12~2017.1 对得到的氯噻啉的噬菌体多肽竞争物进行筛选，选取最佳的多肽竞争物建立免疫分析方法；

2017.1~2017.3整理实验数据，完成论文撰写。