水稻白叶枯病菌Hpa1基因的无痕敲除及功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

hrp基因是1986年lindgren等首次在pseudomonassyringae pv.phaseolieola中克隆获得,之后通过对erwinia amylovora、p. sy ringae、ralstonia solanacearum和xaothomonas campestris等的hrp基因簇进行了全序列测定,发现在植物病原细菌中至少存在25个hrp基因,一般都成簇相连分布;在植物或动物病原细菌中高度保守的hrp基因被称作hrc(hrp conserved)基因,是负责组装成hrpⅢ型泌出系统(typeⅢprotein seeretion systems,ttss或t3ss)的重要蛋白分子,具有将各种病原菌效应蛋白因子转运穿过植物细胞壁和细胞膜至植物细胞内部的能力^[6]。目前已报道有9个hrc基因；还有一类hrp基因,即hpa基因，hpa属于harpin蛋白，harpin 的基本特征是富含甘氨酸、热稳定以及多效性， 这类基因有助于致病性或在非寄主上诱导过敏性反应(hr),但又并非在病原细菌与植物互作的致病过程中所必需的，但能促进植物生长、诱导植物抗病、抗虫、耐旱。^[4][7]这些hrp基因在病原细菌的染色体上占据着20-30kb的区域,一般具有6-13个转录单位,这个区域被称作致病岛(pathogenicity islands,pais)。hrp基因簇中的各个基因协同作用,功能上相当于一个调控单元。它们所编码的大多数效应蛋白(effectorproteins)均能通过Ⅲ型泌出系统穿过细菌的膜、壁和植物细胞质膜。高等植物产生的过敏性反应是一种由不亲和病原菌造成的快速的局部组织细胞死亡,并促使植物对多种细菌、真菌、线虫或病毒产生防卫作用,有利于阻止病原菌对寄主的进一步侵染。但是，对于harpins如何行使自身的多重功能，目前还不清楚^[1][10]。

hpa1定位于植物细胞的质外体，诱导过氧化氢在质外体产生及向原生质转运，进而影响植物防卫反应与对病原细菌的抗性。根据植物水通道蛋白拓扑结构与病原细菌Ⅲ型分泌系统工作模型，水稻ospip1;3 与hpa1 互作的功能域是互作发生的分子基础。互作引发信号转导，调控过氧化氢信号从植物细胞的质外体向原生质转运与植物防卫反应。由于hpa1 对Ⅲ效应蛋白来说具有转位子的功能特征，ospip1; 3-hpa1 还可能对水稻黄单胞菌Ⅲ型效应蛋白从细菌细胞向植物细胞转运发生调控作用^[5]。围绕这些设想进行研究，可以通过无痕敲除方法敲除hpa1基因，通过观察敲除突变体的形状，深入阐释水稻-黄单胞菌互作机制，同时为植物水通道蛋白功能调控提供新的见解^[2][3][8][9]。

为深入研究harpin信号在植物体内传导的机制，选取了水稻白叶枯病菌xanthomonas oryzae pv. oryzae的hpa1基因作为研究对象，通过无痕敲除得到无hap1基因的菌株，并用pxo99野生菌株及实验室先前构建含kan的hpa1敲除突变体作为对照，研究该无痕敲除菌株在水稻品种日本晴上的致病力差异，确定hap1基因对于植物病原物互作和引发植物防卫反应的具体效应。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标:

本课题拟对水稻黄单胞菌基因组dna中的hpa1基因进行定向无痕敲除，确定该基因的功能，逐步揭开其引发的植物防卫信号反应。

研究内容:

3. 研究的方法与方案

研究方法:

本研究构建了无痕敲除质粒pks18-sacb-hpa1，包含hpa1上游及下游同源序列、kan 抗性基因，sacb 基因及有效启动子。其中hpa1上下游重组片段通过同源重组pcr 获得，通过电转化第一次重组实现hpa1的敲除，并在特定位置引入筛选基因 kan 基因和 sacb 基因，第二次重组实现基因组中kan 基因和sacb 基因的去除，经 pcr 鉴定获得无痕敲除菌株。并用pxo99野生菌株及实验室先前构建含kan的hpa1敲除突变体作为对照，研究了该无痕敲除菌株在水稻品种日本晴上的致病力差异。

技术路线：

4. 研究创新点

1. 无痕敲除比Kn敲除更具优势，能做到敲除位点的无痕敲除

2. 同源重组比酶切连接更快捷，也能做到重组片段的无缝连接

5. 研究计划与进展

1、2013年7月2013年8月：查阅文献

2、2013年8月2013年8月：构建载体

3、2013年8月2013年9月：一次交换子的获得