1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 植物内生真菌生活在健康植物组织和器官内部，但不使被感染的宿主植物(至少是暂时)表现出外在病症，它们在进化过程中形成了丰富的代谢系统，对植物某些活性成分的形成有重要影响，甚至会产生和其宿主相同或相似的生理活性成分[1]。 当今内生真菌的研究主要集中在: (1) 基础理论方面的研究: 内生真菌入侵宿主的分子机理 内生真菌的检测和鉴定 内生真菌与宿主的关系 内生真菌在植物体内生命活动的分子调控 在广泛的地理范围内对更多的植物进行内生真菌多样性的研究 内生真菌对宿主和组织专一性机理，分布等生态学问题 (2) 实际应用方面的研究: 内生真菌在植物活力和环境污染检测方面的应用 内生真菌作为植物病害的生物防治 内生真菌产生的重要生物活性物质和酶的筛选[2] 目前从植物内生真菌中分离到的化合物主要包括生物碱类、甾体类、萜类、醌类、酚类、有机酸类、脂类、肽类等[3]。 银杏(Ginkgo biloba L.)为裸子植物亚门银杏纲银杏目银杏科银杏属多年生木本植物，是世界上最古老的中生代孑遗植物，素有 活化石之称，它也是中国特有的珍贵树种，在漫长的生长期中几乎不感染病虫害，寿命极长[4]。根据内共生理论推断，银杏中很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的次生代谢产物帮助增强银杏的抗病害能力[5]。 植物内生真菌是真菌的一个重要类群,总数约达100万种,而现在只有少数几种被开发利用,植物内生真菌资源还远远未被充分发掘[6]。近年来,植物内生真菌本身及其次生代谢产物应用于医药和农业方面的研究逐渐成为热点[7]。 参考文献： [1]STROBEL G, DAISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiology and Molecular Biology Review, 2003, 67: 491-502. [2] 朱士茂. 银杏内生菌的分离与鉴定. 中山大学研究生学刊 ( 自然科学、医学版) 第32卷第4 期, 2011. [3] 孙剑秋，郭良栋，臧威等.药用植物内生真菌及活性物质多样性研究进展[J].西北植物学报，2006，26（7）：1505-1519. [4] 易大为. 银杏树内生真菌代谢产物中活性成分的研究 [D]. 沈阳:沈阳药科大学, 2003. [5] 柏 钰等. 银杏内生真菌 T4 抑菌活性及生物学特性的研究. 安徽农业大学学报, 2011. [6] 王国平等. 一株银杏内生真菌的鉴定及其活性代谢产物研究. 中国生物防治学报,2012 [7] 申屠旭萍, 俞晓平等. 一株银杏内生真菌代谢产物抗菌活性初步研究. 植物保护, 第32卷第3 期( 2006). |
2. 研究的基本内容和问题
本研究采用组织分离法从健康的银杏组织器官中筛选具有抑制植物病原真菌的内生真菌，研究其次生代谢产物，为创制新型生物农药的提供理论依据。
从银杏叶片组织分离出内生真菌，对各菌株发酵液和萃取物浸膏进行抗菌活性筛选，得到一株可能有活性的菌株，发酵得到代谢产物。利用有机溶剂进行萃取，浓缩得粗浸膏，采用普通硅胶柱层析、sephedex lh-20柱层析、hplc等方法进行分离纯化。利用现代波谱学方法鉴定所得化合物的结构。以植物病原菌为作用靶标，测定各化合物的抗菌活性从而发现结构新颖、活性显著的天然化合物。
内生真菌有发酵产生活性物质的产量低等缺点，这也是内生真菌研究领域普遍存在的问题和发展障碍，在今后的工作中将会深入研究内生真菌代谢的具体活性成分，为新型生物农药的开发提供理论依据和技术支撑。
3. 研究的方法与方案
对从银杏叶片分离出的内生真菌，初步挑选了有一定活性物质的NYW1，在培养基内接种培养3-5天之后，转移到三角瓶在摇床上培养10-14天使其发酵得到代谢产物。对发酵液进行过滤，用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂萃取。对提取物做生物测定，以四种重要常见植物病原菌水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）为测定对象，利用生物活性检测法，对各菌株发酵液和萃取物浸膏进行抗菌活性筛选。各相采用普通硅胶柱层析、Sephedex LH-20柱层析、HPLC等方法进行分离纯化。利用现代波谱学方法（包括MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、NOESY等）鉴定所得化合物的结构。以用于进一步研究。
技术路线：
目标菌株分离---发酵---萃取---粗提物生物测定---提取物分体---生物测定
4. 研究创新点
选取的菌株nyw1是实验室直接从银杏叶片中分离出来的。本实验采用组织分离法从健康的银杏组织器官中筛选具有抑制植物病原真菌的内生真菌，为创制新型生物农药的提供理论依据。
植物内生真菌作为一种新兴的微生物资源具备独特优势，包括多样化的代谢类型、 易操作的调控系统和资源丰富等，因此内生真菌作为新型生物农药的开发极具前景和潜力。
银杏中分离出的不同菌株对植物病原菌有不同的作用。本研究意在寻找具有抗菌活性的菌株。着重探讨了菌株nyw1的抗菌活性。
5. 研究计划与进展
2013.8-2013.10 熟悉各种仪器操作及实验过程，分离挑选菌株。查阅文献内生真菌生物筛选和化学筛选
2013.11-2013.12 目标菌株液体发酵，分相萃取
2013.12-2014.1 粗提取物生物活性测定
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