1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1、本项目的研究意义
新城疫是由新城疫病毒强毒引起的鸡和各种禽类的急性高度接触性传染病，病死率高[1]，临床特征表现为呼吸困难、腹泻、神经紊乱、黏膜和浆膜出血[2]，是严重危害养禽业的重要疾病之一，可造成巨大的经济损失[3]，随着我国养禽业疾病防控水平的提高，新城疫已得到了较好的控制[4]。h9亚型禽流感也是目前对肉鸡养殖业危害比较严重的动物疫病，h9亚型禽流感病毒感染鸡群后，会造成大面积呼吸系统疾病[5]，同时严重影响生殖系统，导致产蛋鸡群的产蛋量大幅下降[6]，若管理不善，中后期易出现严重的继发感染，死亡率增加，给养殖业带来严重经济损失[7]。目前，新城疫、禽流感的控制主要依靠疫苗免疫接种[8]，油乳剂灭活疫苗由于具有免疫效果确实、安全性高、免疫持续时间长和生产成本低等优点而应用最为广泛。白油作为佐剂可直接影响疫苗的稳定性及免疫效果，黏度是其重要参数之一，低粘度容易造成油乳剂不稳定，高粘度不能用于机体免疫[9]，选择合适黏度白油对于疫苗制备十分关键，合适黏度白油可以提升疫苗的稳定性，使机体产生高效价的抗体并可以维持更长的时间达到更好的免疫效果。有关新城疫-禽流感二联灭活疫苗中白油佐剂筛选的研究较多，但实际报道却很少，不同生产企业在油乳剂灭活疫苗生产过程中对于白油佐剂的选择存在诸多差异。从白油黏度这方面探究对疫苗免疫效果的影响的文献也比较少，在此方面还有待进一步研究。此外，本实验中动物实验对象为商品肉鸡，贴近企业生产实际，相比于实验用spf鸡具有较大实际意义。本研究拟通过使用不同黏度的白油佐剂制备鸡新城疫-禽流感（h9亚型）二联灭活疫苗，对商品肉鸡进行免疫，以筛选出免疫效果好、安全性高的白油佐剂，为鸡新城疫和禽流感 (h9亚型) 二联灭活疫苗的临床使用提供实验依据。
2、国内外研究现状
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目标
本研究通过使用不同黏度的白油佐剂制备的鸡新城疫、禽流感（h9亚型）二联灭活疫苗，对肉鸡进行免疫，评价免疫效果，为该产品顺利应用于生产实际提供实验依据。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法及方案
（1）病毒浓缩灭活：对公司提供的新城疫、禽流感病毒原液进行红细胞凝集（HA）效价检测和浓缩灭活，①取一96孔V型微量血凝板，每孔加入25μLPBS。②第一列前两孔加入新城疫病毒原液25μL，三四孔加入禽流感（H9亚型）病毒原液25μL，第五孔加入标准抗原，第六孔不加抗原为阴性对照。③倍比稀释抗原至最后一孔，弃去25μL。④每孔加入1%鸡红细胞悬液25μL，室温孵育30min后判定结果。⑤对浓缩好的病毒原液进行无菌检验，检验合格的病毒原液用甲醛按0.1%的浓度灭活。⑥灭活好的毒液接种鸡胚尿囊腔接种进行灭活效果检验，接种24-68小时内鸡胚非特异性死亡不超过20%，死亡鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验为阴性，120小时收集活胚尿囊液混合，对鸡红细胞凝集试验为阴性则灭活成功，确认灭活成功的两种毒液混合后放于4℃保存。
（2）筛选HLB值：按下表制备疫苗（不加抗原），①油相制备：按表加入白油和Span-80，边加边搅拌至充分混匀。②水相制备：按表加入PBS和Tween-80，边加边搅拌至充分混匀。③乳化：油相置于剪切分散乳化机下，启动乳化机，缓慢加入水相，剪切速度10000rpm，乳化2min，将剪切速度调至22000rpm，乳化6min，制成疫苗。比较各组别疫苗的黏度、粒径、稳定性及剂型，选出最合适的HLB值应用于后续疫苗制备。④黏度：用黏度计测定，读取黏度数据。⑤粒径：使用激光粒度仪检测颗粒粒径分布，通过图像分析系统显示出粒径分布图。50%的颗粒粒径的值越小，且粒径分布曲线范围越窄，说明整体粒径越小越均匀。⑥稳定性：倒1mL制备的疫苗于离心管，于23℃，离心率937xg条件下离心15min，观察是否分层，再于37℃下静置观察21天，看是否出现破乳现象。⑦剂型：吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均应不扩散，则为油包水剂型。于光学显微镜下观察剂型是否为油包水，是否分布均匀。
| 组别 | PBS（ml） | Marcol-52（ml） | Tween-80（ml） | Span-80（ml） | HLB值 |
| 1 | 50 | 100 | 1.2 | 6.3 | 6 |
| 2 | 50 | 100 | 1.9 | 5.6 | 7 |
| 3 | 50 | 100 | 2.6 | 4.9 | 8 |
（3）白油黏度测定：对选用的KF-32、KF-40、KF-50、Marcol-52及国产白油五种不同白油进行黏度的测定，测定方法如上。
（4）疫苗制备：使用以上五种不同白油分别作为佐剂，按筛选出的最适HLB值制备五种新城疫-禽流感二联灭活疫苗，水相：油相为1:2，过程严格按照中国兽用生物制品质量标准进行，对制备好的疫苗进行稳定性及剂型的测定。
（5）动物实验：①将42只7日龄肉鸡分为6组，每组7只。②其中5组每只分别颈部皮下注射0.2mL制备的5种新城疫、禽流感二联灭活疫苗，剩余1组不做处理作为阴性对照。③免疫后21天和28天抽血，通过血凝抑制试验进行血清抗体效价的测定，以此比较各疫苗的免疫效果。
（6）抗体效价测定：血凝抑制试验测定效价，①按（1）中血凝试验的步骤检测灭活新城疫、禽流感抗原效价。②根据抗原效价进行四单位抗原的制备，制备好后进行回滴试验。③取干净96孔V型微量血凝板，每孔加入25μLPBS，每行第一孔加入25μL各待检血清样品，进行倍比稀释，至最后一孔弃去25μL。每孔加入25μL四单位抗原，孵育15-30min，再往每孔加入25μL1%鸡红细胞悬液，室温孵育30min后判定结果。最后应设置一行阳性对照和一行阴性对照，步骤与血凝试验中一致。
2、技术路线
浓缩灭活病毒→筛选HLB→白油黏度测定→疫苗制备及性状检测→动物实验→抗体效价测定
3、可行性分析
（1）查阅了大量的相关的技术资料，设计了合理的技术方案和路线，初步建立了相关的试验方法和检测手段。
（2）本试验将在天津瑞普生物科技股份有限公司疫苗研发实验室开展，该实验室仪器设备先进齐全，技术力量强，具备进行本课题研究的基本条件。
4. 研究创新点
有关新城疫-禽流感二联灭活疫苗中白油佐剂筛选的研究较多，但实际报道却很少，不同生产企业在油乳剂灭活疫苗生产过程中对于白油佐剂的选择存在诸多差异。从白油黏度这方面探究对疫苗免疫效果的影响的文献也比较少，在此方面还有待进一步研究。此外，本实验中动物实验对象为商品肉鸡，贴近企业生产实际，相比于实验用SPF鸡具有较大实际意义。
5. 研究计划与进展
2018.10—2018.11 完成相关文献资料的查阅
2018.11—2018.12完成疫苗制备及相关性状的检测
2018.12—2019.1 完成动物实验
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