猪链球菌2型类溶血素蛋白基因的原核表达及其抗血清制备开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪链球菌(streptococcus suis, ss)是一种重要的人兽共患病原菌，根据荚膜多糖抗原性的差异，分为33个血清型，其中2 型 ( streptococcus suis type 2 , ss2) 最为常见、毒力最强、危害最严重[1]。

不仅可以引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡。

1998年江苏和2005年四川暴发了由ss2引致的人及猪的链球菌病，引起了全世界的关注。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：利用大肠杆菌原核表达猪链球菌2型类溶血素蛋白，制备多克隆抗体。

研究内容：1.pcr扩增ss2强毒株ss2-1类溶血素蛋白的编码基因；2.克隆到原核表达载体pet28a，构建重组表达质粒；3.在bl21（de3）中表达重组蛋白，并纯化重组蛋白；4．免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；5.进行类溶血素蛋白的功能验证。

拟解决的关键问题： 构建重组表达质粒，纯化重组蛋白，并制备多克隆抗体

3. 研究的方法与方案

研究方法：采用pcr 从猪链球菌2 型强毒株ss2-1基因组扩增目的基因hlyc，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌bl21 (de3) ，筛选阳性转化子进行iptg诱导表达，sds-page 鉴定表达产物，his 亲和层析柱纯化重组蛋白，重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。

技术路线：1、基因的生物信息学分析2、目的基因的pcr 扩增及克隆3、重组表达载体的构建和鉴定4、重组蛋白的表达及其产物的纯化5、兔抗重组蛋白血清的制备6、类溶血素蛋白功能验证实验方案：1、基因的生物信息学分析2、重组表达载体的构建和鉴定（1）目的基因的pcr 扩增及克隆（2）目的基因与载体连接后转化（3）重组载体的鉴定-双酶切鉴定3、重组蛋白的表达及其产物的纯化-sds-page电泳4、兔抗重组蛋白血清的制备5、类溶血素蛋白功能验证可行性分析：本研究的关键是构建重组表达质粒，筛选阳性转化子。

目前试验进展顺利，应该能够成功。

4. 研究创新点

前期研究发现猪链球菌中存在一个与多种链球菌的溶血素具有较高同源性的编码蛋白hlyc（hemolysins and related proteins containing cbs domains，hlyc），目前，该基因的功能尚不清楚。

本研究猪链球菌2型类溶血素样蛋白编码基因并进行原核表达，纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。

为深入研究该基因的功能奠定基础。

5. 研究计划与进展

2015年8月31日-2015年9月31日 重组表达载体的构建和鉴定2015年9月31日-2015年10月31日 重组蛋白的表达及其产物的纯化2015年11月1日-2015年11月30日 兔抗重组蛋白血清的制备 2015年12月1日-2015年12月31日 蛋白功能验证定位