南京地区两家宠物医院犬细小病毒的分离鉴定及遗传进化分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义犬细小病毒（canine parvovirus，cpv）是1977年澳大利亚的kelly和加拿大的thomson等同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的[1]，自1978年中期起，全世界广泛地区，几乎同时在所有年龄犬中爆发。

我国于1980年开始流行本病，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。

犬细小病毒病是一种急性、以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬科和鼬科动物的传染病[2]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的内容样品的采集；病毒的分离鉴定；遗传进化分析2.研究的目标本研究旨在对采样得到的疑似犬细小病毒感染的犬肛拭子样品进行分离鉴定，从分子水平上，系统地对所分离的犬细小病毒的变异情况进行分析，为进一步了解犬细小病毒的遗传进化情况和流行病学情况，对以后研究犬细小病毒的基因变异以及更有效的防治犬细小病毒病具有重要参考价值。

2.1样品的采集从南京地区的马群与麒麟门两处的博研宠物医院收集到至少40个疑似病例样本，有呕吐、腹泻症状或者确诊为犬细小病毒感染。

2.2病毒分离鉴定分离：5代之内有cpe，典型细胞病变为细胞出现圆缩和脱落等细胞变化。

3. 研究的方法与方案

1.实验方案1.1实验材料1.1.1细胞与病料f81细胞为实验室所提供；患病犬病料样品为2016年8月29日～2016年12月30日间从南京市马群以及麒麟门的两家博研宠物医院收集的有呕吐、腹泻症状或者确诊为犬细小病毒感染的肛拭子样品。

1.1.2主要试验试剂dmem培养基；葡萄糖、谷氨酰胺、二甲基亚枫（dmso）；dl-15000、dl-2000 dna-marker、r taq dna聚合酶及ex-taq dna聚合酶（5u/μl）、pmd18-t载体；t4 dna连接酶；质粒小量提取试剂盒（plasmid mini-prep kit）、dna回收试剂盒（dna gel extractionkit）；hindⅢ、xhoⅠ等限制性内切酶；双抗（青、链霉素）。

1.1.3主要器材及仪器96孔v型血凝板、微型血凝振荡器。

4. 研究创新点

利用PCR鉴定病毒，利用测序技术获得保守区的基因序列，构建系统发生关系，基于邻接法（Neighbor-joining）构建绘制系统进化树以及VP2的基因序列分析以研究CPV的遗传进化特点。

5. 研究计划与进展

1.2016年8月29日～2016年12月30日：实习单位实习。

具体收集疑似的犬细小病犬的肛拭子，并记录病犬的各项指标，对应冷冻保存以备实验。

2.2017年2月28日～2017年5月15日：完成实验室的病毒分离鉴定以及遗传进化分析，记录数据，择写毕业论文。