猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其单克隆抗体的制备开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪瘟（classical swine fever, csf）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus, csfv）引起的严重危害养猪业的一种高度接触性传染病[1-4]。

csf通常会引起高热、出血综合征，具有较高的死亡率[5]，被世界动物卫生组织（oie）列为a类法定报告传染病[6]，并规定为国际贸易重要检疫对象。

在《国家中长期动物疫病防治规划（2012~2020）》中，猪瘟也被列为优先防控的重大动物疫病之一。

2. 研究的基本内容和问题

1.1研究目标：本研究通过原核表达猪瘟病毒（csfv）保护性抗原e2蛋白，制备能够稳定分泌抗e2蛋白特异性单克隆抗体的的杂交瘤细胞株。

为csfv 血清抗体阻断elisa检测试剂盒的研发奠定了基础。

1.2研究内容：（1）猪瘟病毒（csfv）保护性抗原e2蛋白的原核表达；（2）以纯化的e2蛋白免疫balb/c小鼠，取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，以e2蛋白作为包被抗原，用间接elisa检测方法筛选阳性细胞克隆，获得能够稳定分泌e2蛋白特异性单克隆抗体的的杂交瘤细胞株。

3. 研究的方法与方案

2.1技术路线：（1）猪瘟病毒e2基因的rt-pcr扩增（2）将e2基因插入到原核表达载体中，转化大肠杆菌rosetta(de3)（3）猪瘟病毒保护性抗原e2蛋白的表达、纯化（4）e2蛋白特异性单克隆抗体的制备（5）e2蛋白特异性单克隆抗体的鉴定2.2实验方案：2.2.1猪瘟病毒e2蛋白的原核表达以猪瘟病毒石门株基因组rna为模板，rt-pcr扩增e2基因。

上游引物p1：5ggatccatgggttgctctttctctatcttcc3，5端加上bamh i酶切位点；下游引物p2：5gaattcttacgcctccgcttgggatatgagtaa3，5端加上ecor i酶切位点，扩增片段为1270 bp，含有信号肽序列区和跨膜区的全长e2基因。

pcr产物经bamh i和ecor i双酶切后回收并纯化含e2基因片段，定向插入原核表达载体pet-32a( )中，得到e2蛋白原核表达载体pet-32a-e2。

4. 研究创新点

目前国内商品化的猪瘟病毒抗体检测试剂盒大多采用间接elisa方法，该方法虽然敏感性尚可，但特异性稍差，与牛病毒性腹泻性病毒(bvdv)以及边界病（bdv）等抗体有一定的交叉反应。

本研究通过原核表达猪瘟病毒（csfv）保护性抗原e2蛋白，制备能够稳定分泌抗e2蛋白特异性单克隆抗体的的杂交瘤细胞株。

为csfv 血清抗体阻断elisa检测试剂盒的研发奠定了基础。

5. 研究计划与进展

2016年9月～2016年11月 猪瘟病毒E2蛋白的原核表达；2016年11月～2017年12月 动物免疫；2017年2月～2017年4月E2蛋白特异性单克隆抗体的制备；2017年4月～2017年5月E2蛋白特异性单克隆抗体的鉴定。