铜绿假单胞菌磷酸二酯酶基因PA4781的功能验证开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述1.引言铜绿假单胞菌是一种在自然界中普遍存在的革兰氏阴性细菌，可存在于从土壤到哺乳动物宿主等多种环境中。

作为一种条件致病菌，它的定植和感染会导致人体免疫系统受损、上皮损伤或肺囊纤维化等问题[1-3]。

除了毒力因子外，借助包括外毒素a、外酶s、吩嗪、鼠李糖脂和脂多糖，铜绿假单胞菌还能够根据环境刺激将其生活方式从浮游生长模式转变为表层吸附的生长模式（生物膜），表层吸附的生长模式主要表现为生物膜的积累，由于这些生物膜会导致菌体的抗生素耐受性增加且可以作为宿主的感染源[7,8]，因此生物膜相关感染在医学领域引起了极大的关注。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1. 本课题的研究目的第二信使环鸟嘌呤二磷酸（c-di-gmp）的浓度与铜绿假单胞菌的生长模式密切相关，而磷酸二酯酶（pde）是一类通过降解c-di-gmp进而调控其浓度的关键酶。

本课题基于c-di-gmp调控相关基因缺陷型突变菌株文库，选取关键磷酸二酯酶基因pa4781作为研究对象，通过基因敲除和质粒过表等技术手段考察基因pa4781的生理功能及其对菌株生长模式转化的潜在影响。

2. 拟采用的研究手段（1）运用聚合酶链式反应（pcr）和重叠延伸pcr技术获取目的基因片段；（2）构建基于pex18-gm自杀质粒平台的基因pa4781敲除质粒，选择合适的转化方式构建重组菌株并进行目标缺陷型菌株筛选，后续对缺陷型菌株进行生理特性表征，考察基因功能；（3）构建基于pbbr-mcs-5表达质粒平台的pa4781表达载体，分别转入野生型和缺陷型菌株进行生理特性表征，验证基因功能；基于实验结果进行分析讨论，推测基因pa4781在铜绿假单胞菌生长模式转化过程中的作用。